李致池， 張?jiān)绿m

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科(遼寧沈陽 110001)

動脈粥樣硬化的特征是內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)積聚、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤、血管平滑肌細(xì)胞增殖、結(jié)締組織增生和各種大小動脈中動脈粥樣硬化斑塊的形成。導(dǎo)致動脈壁增厚和彈性喪失，是冠狀動脈疾病、缺血性卒中、頸動脈狹窄、腎動脈阻塞、視網(wǎng)膜動脈阻塞、外周動脈疾病等多種嚴(yán)重動脈閉塞性疾病的主要原因[1-2]。迄今為止，動脈粥樣硬化的確切潛在致病機(jī)制尚未完全闡明。然而，有充足的證據(jù)支持各種信號通路的異常表達(dá)在動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中起著核心作用[3]。類Toll受體(Toll like receptors, TLR)與其相應(yīng)配體的結(jié)合導(dǎo)致銜接蛋白的募集、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活、細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)，最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)的發(fā)展。先前的研究表明，與TLR信號通路密切相關(guān)的炎癥標(biāo)志物，如C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α、細(xì)胞間黏附分子-1和白細(xì)胞介素-6，在動脈粥樣硬化患者中顯著升高[4]。此外，研究指出激活TLR信號通路可促進(jìn)動物模型的動脈粥樣硬化[5]。近年來，越來越多的研究關(guān)注微小RNA(microRNA, miRNA)在血管疾病中的作用。miRNA是一組進(jìn)化上保守的、內(nèi)源性的、非編碼的、長度為18～22個核苷酸的RNA。通過在轉(zhuǎn)錄后水平與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region, 3′UTR)配對，負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過mRNA降解或翻譯抑制導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低。miRNA參與多種病理生理過程，包括分化、生長、增殖和凋亡[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA可以通過多種靶向因子或關(guān)鍵信號通路調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究指出，miR-590可以通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB通路，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響動脈粥樣硬化進(jìn)程[8]；miR-15能夠通過mTOR信號通路介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞自噬并影響冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[9]。miR-587目前被認(rèn)為與結(jié)腸癌的耐藥相關(guān)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡的作用[10]，報(bào)道指出，血清miR-587水平與空腹血糖呈負(fù)相關(guān)，與總膽固醇呈負(fù)相關(guān)[11]，但是miR-587在動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制目前尚無研究。本課題組的前期研究指出，miR-587在ox-LDL處理的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells, HAECs)中表達(dá)較低，并且通過生物學(xué)軟件預(yù)測得知miR-587能夠靶向結(jié)合TLR4，由此推斷miR-587可能在動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用。2019年3—9月，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-587可以通過調(diào)節(jié)TLR4通路影響人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HAECs實(shí)驗(yàn)室凍存，DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle Media)培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(天津?yàn)?，天?培養(yǎng)。TLR4 和GAPDH抗體及相關(guān)二抗購自美國Santa Cruz。TLR4 WT, TLR4 MUT(突變與miR-587結(jié)合位點(diǎn)的序列)引物均合成于上海生工。熒光素酶報(bào)告基因試劑盒，SBYR試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。miR-587 mimic(擬似物), miR-587 inhibitor(抑制物)及NC control(對照)購自于廣州銳博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HAECs使用含10%胎牛血清的DMEM，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 ox-LDL處理HAECs 細(xì)胞生長約70%～80%密度，添加100 μg/mL的ox-LDL(Unionbiol，中國北京)孵育24 h。

1.2.3 細(xì)胞活力測定 分別將miR-587 mimic/inhibitor和control轉(zhuǎn)染到HAECs后，得到miR-587過表達(dá)/低表達(dá)的細(xì)胞系。我們利用MTT的方法，于0、12、24、36和48 h這幾個時(shí)間點(diǎn)分別檢測細(xì)胞增殖情況，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化銨(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromid, MTT)測定細(xì)胞活力。將細(xì)胞以每孔2×104的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)基為200 μL，并用NC-control、miR-587 mimic或miR-587 inhibitor分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后，在不同時(shí)間點(diǎn)將20 μL MTT溶液(5 mg/mL；sigma)添加到每個孔中，并在37℃下再培養(yǎng)4 h。隨后，丟棄上清液并添加150 μL二甲基亞砜以溶解甲贊晶體。用酶標(biāo)儀(Molecular Devices, Sunnyvale, 美國)測量490 nm處的光密度。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析 在HAECs細(xì)胞中過表達(dá)了或沉默表達(dá)miR-587，采用JC-1細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences，美國)對不同處理因素作用后細(xì)胞的凋亡進(jìn)行評估。用PBS洗滌2次細(xì)胞，消化，然后在200 μL結(jié)合緩沖液中將2×105細(xì)胞/mL的密度重新懸浮。然后，在黑暗中用5 μL的JC-1對細(xì)胞進(jìn)行15 min染色。最后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Real-time PCR 分別檢測ox-LDL處理的HAECs以及正常的HAECs中miR-587和TLR4的表達(dá)情況，用TRIzol(invitrogen，上海碧云天生物有限公司)從細(xì)胞中提取總RNA。為了測定miR-587和TLR4的含量，使用Taqman反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Rad Laboratories, 上海碧云天生物有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在CFX96TM實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，美國)上進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。

U6和GAPDH被作為內(nèi)參。引物如下:(1)miR-587: 5′-CCAGGCAAGAGAGAGUUGCUG-3′(正向),5′-AGUCACAGGUGCAGACACAUU-3′(反向)；(2)U6:5′-GCUUCGGCAGCACAUAUACUAAAAU-3′(正向),5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′(反向)；(3)TLR4:5′-TGATGTCTGCCTCGCGCCTG-3′(正向),5′-TAGGAACCACCTCCACGCAGGG-3′(反向)；(4)GAPDH:5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′(正向),5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′(反向)。

1.2.6 Western blot 為了檢測miR-587與TLR4之間相互作用關(guān)系，分別行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染miR-587后TLR4受體及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase 8的表達(dá)及再次轉(zhuǎn)染TLR4后是否可以抵消miR-587對HAECs的促進(jìn)增值及抑制凋亡作用，使用含有蛋白酶抑制劑(sigma)的RIPA溶解緩沖液(invitrogen，上海碧云天生物有限公司)，從處理過的細(xì)胞中提取蛋白。等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(MiLople，Bead For，美國)。在含有0.05%吐溫-20的TBS中用5%脫脂奶粉乳封閉2 h后，將膜與一抗(TLR4和GAPDH)在4℃孵育過夜，然后在室溫下與辣根過氧化物酶結(jié)合二抗(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，美國)孵育1 h。ECL試劑盒(GE Healthcare，Solingen，德國)進(jìn)行發(fā)光。

1.2.7 結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證 為驗(yàn)證miR-587與TLR4可以特異性結(jié)合通過生物學(xué)軟件MicroRNA Database預(yù)測尋找miR-587與TLR4可能的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告分析 合成了含有miR-587假定結(jié)合位點(diǎn)的TLR4的3′UTR序列，并將其插入PMIR報(bào)告熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(Promega，Madison，WI，美國)中，得到TLR4 WT(上海生工生物有限公司)，TLR4 MUT(在miR-587結(jié)合位點(diǎn)具有突變序列)。將細(xì)胞接種到具有200μL培養(yǎng)基的96孔板中，并分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-587或?qū)φ?。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)分3次進(jìn)行，所有結(jié)果顯示為3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，并進(jìn)行方差分析或?qū)W生t檢驗(yàn)的單向分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-587和TLR4在ox-LDL處理的HAECs中的表達(dá)情況 ox-LDL處理后能夠上調(diào)細(xì)胞中的TLR4表達(dá)并且下調(diào)miR-587的表達(dá)，見圖1。

注：*與control比較 P<0.05

2.2 miR-587對人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)作用 miR-587對細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，miR-587抑制劑能夠明顯抑制細(xì)胞增殖(P<0.05), 其中miR-587作用細(xì)胞24 h時(shí)對于細(xì)胞增殖的促進(jìn)率為(36.77±6.00)%，miR-587抑制劑作用細(xì)胞24 h時(shí)對細(xì)胞增殖的抑制率為(38.01±5.62)%，見表1。研究者在HAECs細(xì)胞中過表達(dá)了或沉默表達(dá)miR-587，并且通過JC-1染色檢測細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-587能夠抑制細(xì)胞的凋亡，結(jié)果見圖2。

圖2 miR-587對細(xì)胞凋亡能力的影響

表1 不同處理因素對細(xì)胞增殖情況的影響

2.3 miR-587對TLR4的調(diào)節(jié)作用 miR-587與TLR4的3′UTR區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。

圖3 miR-587與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

2.3.1 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 當(dāng)miR-587與TLR4共同轉(zhuǎn)染時(shí)，TLR4的活性顯著下調(diào)，當(dāng)miR-587與TLR4 MUT共同轉(zhuǎn)染時(shí)，不會影響TLR4的活性， miR-587可以直接作用于TLR4，見圖4。

注：*與control相比P<0.05

2.3.2 構(gòu)建了miR-587過表達(dá)/沉默表達(dá)的細(xì)胞系 結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-587對TLR4有一定的抑制作用，見圖5。

圖5 miR-587對TLR4蛋白的影響

2.3.3 miR-587對Caspase 8的影響 miR-587過表達(dá)能夠下調(diào)Caspase 8的表達(dá)，見圖6。

圖6 miR-587對相關(guān)蛋白的影響

2.3.4 TLR4對miR587促進(jìn)增殖作用的影響 miR-587明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TLR4可以恢復(fù)由miR-587過表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,與miR-587組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同處理因素對細(xì)胞增殖情況的影響

2.3.5 TLR4對miR578抑制凋亡作用的影響 TLR4的添加能夠恢復(fù)由miR-587造成的凋亡抑制，見圖7。

圖7 細(xì)胞凋亡能力的檢測

2.3.6 Western blot檢測miR-587對于細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase 8的調(diào)節(jié)作用 結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4能夠恢復(fù)由于miR-587導(dǎo)致的TLR4和Caspase 8表達(dá)下調(diào)，見圖8。

圖8 相關(guān)蛋白的檢測

3 討論

研究表明動脈粥樣硬化的進(jìn)展是一個復(fù)雜的多步驟過程。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可能受到內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，被認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)病的主要因素[8]。近年來，由于其在動脈粥樣硬化進(jìn)展中的重要調(diào)控作用，miRNA越來越引起人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，miR-98可促進(jìn)暴露于ox-LDL的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并減輕其凋亡[12]。miR-126可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的Thp-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚，從而成為動脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)[13]。外源性的miR-590過度表達(dá)可減輕HFD喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化病變，維持細(xì)胞增殖，并抑制ox-LDL治療的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[14]。

在目前的研究中，我們首先證明了在ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs細(xì)胞中miR-587表達(dá)下調(diào)。并且通過MTT和JC-1實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-587具有促進(jìn)HAECs細(xì)胞增殖抑制其凋亡的作用。

TLR是一種進(jìn)化上保留的模式識別受體，由于其固有免疫、炎癥和動脈粥樣硬化之間的聯(lián)系，最近受到越來越多的關(guān)注。作為TLR家族中研究最廣泛的受體，TLR4在動脈粥樣硬化不同階段的動脈粥樣硬化病變中大量表達(dá)，據(jù)報(bào)道，TLR4缺乏可減弱ApoE-/-小鼠的主動脈動脈粥樣硬化病變區(qū)域和炎癥細(xì)胞因子水平，提示TLR4在動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[15]。有報(bào)道指出，miR-590過表達(dá)通過抑制TLR4/ NF-κB途徑，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的載脂蛋白E缺陷小鼠動脈粥樣硬化病變，促進(jìn)ox-LDL治療的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制凋亡[8]。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)TLR4在ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)論與前人的結(jié)果相似。由于miR-587能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，抑制caspase 8的表達(dá)，并且其表達(dá)變化情況與TLR4相反。研究者通過生物學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR-587與TLR4具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了miR-587能夠通過靶向結(jié)合作用下調(diào)TLR4的生物學(xué)活性，western blot實(shí)驗(yàn)指出，miR-587能夠抑制TLR4的表達(dá)，miR-587受到抑制后TLR4的表達(dá)受到促進(jìn)。在本研究中，我們將TLR4轉(zhuǎn)染到過表達(dá)miR-587的細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4的轉(zhuǎn)染能夠在一定程度上恢復(fù)由于miR-587造成的細(xì)胞增殖的促進(jìn)和細(xì)胞凋亡的抑制，并且能夠恢復(fù)miR-587造成的caspase 8的表達(dá)下調(diào)。

本研究表明，miR-587可以通過抑制TLR4參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，可能為動脈粥樣硬化的臨床治療提供新的可能。