閆姿伶，趙欣迪，黃璞祎

(東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

魚體皮膚黏液細(xì)胞能分泌多種活性物質(zhì)，如酸性黏多糖、中性黏多糖等，這些物質(zhì)可以有效降低外物對魚體的摩擦作用，具有保護(hù)和潤滑功能，能夠保證魚體生命活動正常有序地進(jìn)行[1-2]，而底棲魚類易受其所在環(huán)境中異物和病原體的侵害，因此，開展底棲魚類皮膚黏液細(xì)胞類型與分布的相關(guān)研究具有重要意義。泥鰍Misgurnusanguillicaudatus又稱真泥鰍，隸屬于鯉形目鰍科泥鰍屬，其身體鱗片細(xì)小，埋于皮下，大多鱗片已退化[3]；葛氏鱸塘鱧Perccottusglenii俗稱老頭魚，隸屬于鱸形目蝦虎魚亞目塘鱧科，其身體鱗片中等大小，頭和鰓蓋均有鱗片分布[4]。鱗片退化魚類泥鰍和鱗片正常魚類葛氏鱸塘鱧均為底棲淡水經(jīng)濟(jì)魚類，是中國北方高寒地區(qū)的特色養(yǎng)殖魚類[5-6]。目前，國內(nèi)外對泥鰍黏液細(xì)胞的研究多集中在消化道方面[7-8]，而對葛氏鱸塘鱧黏液細(xì)胞的研究幾乎未見報(bào)道，為此，本研究中通過對中國東北高寒地區(qū)常見的淡水底棲魚類泥鰍和葛氏鱸塘鱧在4個(gè)季節(jié)中皮膚黏液細(xì)胞的分布情況進(jìn)行差異比較，探究淡水底棲鱗片退化魚類和鱗片正常魚類皮膚黏液細(xì)胞類型與分布的季節(jié)變化，旨在為高寒地區(qū)淡水底棲魚類養(yǎng)殖和魚病防治等方面提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國高寒地區(qū)淡水底棲魚類泥鰍和葛氏鱸塘鱧為試驗(yàn)材料，于2018年4、7、9、11月分別在松花江流域哈爾濱段采集健康野生泥鰍和葛氏鱸塘鱧，每次每種魚均采集5 尾，泥鰍體質(zhì)量為(8.5±2.1)g、體長為(13.2±2.5)cm，葛氏鱸塘鱧體質(zhì)量為(14.0±3.8)g、體長為(9.7±1.2)cm。

1.2 方法

1.2.1 組織化學(xué)染色 試驗(yàn)魚采集后立即處死，分別取4個(gè)季節(jié)泥鰍和葛氏鱸塘鱧頭部、背部、腹部、尾部皮膚組織若干，將獲取的樣品直接浸入Bouin’s液固定，用常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，用阿利新藍(lán)(AB，pH 2.6)和過碘酸雪夫(PAS)試劑染色。

1.2.2 黏液細(xì)胞計(jì)數(shù) 利用Leica顯微鏡，在43.5 μm×32.6 μm視野下，分別于4個(gè)季節(jié)中兩種魚頭、背、腹、尾4個(gè)部位皮膚的相應(yīng)切片中隨機(jī)選擇10 個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，共計(jì)320 個(gè)視野，觀察并統(tǒng)計(jì)泥鰍和葛氏鱸塘鱧在不同季節(jié)不同部位的黏液細(xì)胞類型和數(shù)目。

1.2.3 黏液細(xì)胞分類標(biāo)準(zhǔn) 參照尹苗等[9]對魚類黏液細(xì)胞類型的劃分方法，根據(jù)試驗(yàn)中AB-PAS染色結(jié)果將黏液細(xì)胞劃分為以下4種類型：Ⅰ型黏液細(xì)胞為紅色，AB陰性、PAS陽性，主要含中性黏多糖；Ⅱ型黏液細(xì)胞為藍(lán)色，AB陽性、PAS陰性，主要含酸性黏多糖；Ⅲ型黏液細(xì)胞為紫紅色，AB、PAS均為陽性，主要含PAS陽性的中性黏多糖及少量AB陽性的酸性黏多糖；Ⅳ型黏液細(xì)胞為藍(lán)紫色，AB、PAS均為陽性，主要含AB陽性的酸性黏多糖及少量PAS陽性的中性黏多糖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),用LSD法進(jìn)行組間多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)兩種魚皮膚黏液細(xì)胞的形態(tài)特征

兩種底棲魚類皮膚中4種類型的黏液細(xì)胞在不同季節(jié)中均存在，但隨季節(jié)變化呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征：(1)在泥鰍頭部、背部和腹部，春夏秋季皮膚黏液細(xì)胞的形態(tài)特征基本一致，藍(lán)色Ⅱ型黏液細(xì)胞體積最大且形態(tài)以囊狀為主，藍(lán)紫色Ⅳ型黏液細(xì)胞體積最小且以球狀為主，Ⅲ型黏液細(xì)胞體積較大且形狀多為不規(guī)則狀(圖1-A～C、E～G、I～K)，冬季皮膚黏液細(xì)胞中Ⅱ型黏液細(xì)胞主要以棒狀為主，Ⅳ型黏液細(xì)胞以球狀或不規(guī)則狀為主(圖1-D、H、L)；在尾部，4個(gè)季節(jié)皮膚黏液細(xì)胞中Ⅱ型黏液細(xì)胞主要呈棒狀分布，Ⅳ型黏液細(xì)胞多呈現(xiàn)不規(guī)則狀(圖1-M～P)。(2)在葛氏鱸塘鱧頭部、背部和腹部，春夏兩季皮膚黏液細(xì)胞的形態(tài)特征相似，紫紅色Ⅲ型黏液細(xì)胞和藍(lán)紫色Ⅳ型黏液細(xì)胞以圓形為主，紅色Ⅰ型黏液細(xì)胞多呈點(diǎn)狀不均勻分布(圖2-A、B、E、F、I、J)，秋冬兩季皮膚黏液細(xì)胞中Ⅲ型黏液細(xì)胞以橢圓狀居多，Ⅳ型黏液細(xì)胞主要呈圓形分布(圖2-C、D、G、H、K、L)；在尾部，春夏秋三季皮膚黏液細(xì)胞的形態(tài)與頭部春夏季基本相同，Ⅲ型和Ⅳ型黏液細(xì)胞均呈圓形分布(圖2-M～O)，冬季黏液細(xì)胞中Ⅲ型和Ⅳ型黏液細(xì)胞多呈現(xiàn)橢圓狀(圖2-P)。(3)泥鰍皮膚黏液細(xì)胞內(nèi)容物著色較深且夏冬兩季染色要深于春秋兩季，而葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞內(nèi)容物著色較淺。

圖2 4個(gè)季節(jié)葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞的顯微鏡觀察(100×20)Fig.2 Microscopic observation of mucous cells in skin of Chinese sleeper Perccottus glenii in four seasons (100×20)

2.2 不同季節(jié)兩種魚皮膚黏液細(xì)胞的類型分布

泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚中黏液細(xì)胞的類型分布隨季節(jié)變化存在顯著性差異(表1，表2，P<0.05)：(1)在泥鰍頭、背、腹、尾4個(gè)部位，春季和夏季皮膚黏液細(xì)胞均以Ⅳ型黏液細(xì)胞數(shù)量居多，其次為Ⅱ型黏液細(xì)胞，Ⅲ型黏液細(xì)胞數(shù)量較少，幾乎不含Ⅰ型黏液細(xì)胞；秋季皮膚中分布有大量的Ⅱ型黏液細(xì)胞，其次為Ⅲ型、Ⅳ型黏液細(xì)胞，Ⅰ型黏液細(xì)胞幾乎無分布；冬季黏液細(xì)胞同樣以Ⅱ型黏液細(xì)胞為主，其次為Ⅳ型黏液細(xì)胞，Ⅰ型和Ⅲ型黏液細(xì)胞分布極少。(2)在葛氏鱸塘鱧頭、背、腹、尾4個(gè)部位，春季、夏季和秋季皮膚黏液細(xì)胞中主要分布的是Ⅲ型黏液細(xì)胞，其次為Ⅳ型黏液細(xì)胞，Ⅰ型和Ⅱ型黏液細(xì)胞數(shù)量很少；冬季皮膚中也以Ⅲ型黏液細(xì)胞為主，依次分布的Ⅰ型、Ⅳ型黏液細(xì)胞數(shù)量基本相同，Ⅱ型黏液細(xì)胞幾乎無分布。

表2 不同季節(jié)葛氏鱸塘鱧皮膚中4種類型黏液細(xì)胞數(shù)量

表1 不同季節(jié)泥鰍皮膚中4種類型黏液細(xì)胞數(shù)量

2.3 不同季節(jié)兩種魚皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)的分布

在不同季節(jié)泥鰍和葛氏鱸塘鱧4個(gè)部位的皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)存在顯著性差異(表3，P<0.05)：(1)泥鰍春夏季皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)的變化范圍主要為200～350，秋冬季皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)的變化范圍主要為50～150，泥鰍頭部和腹部皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)的季節(jié)分布依次為春季>夏季>秋季>冬季，背部和尾部黏液細(xì)胞總數(shù)的季節(jié)分布依次為春季>夏季>冬季>秋季。(2)葛氏鱸塘鱧4個(gè)季節(jié)皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)的變化范圍主要在10～30，葛氏鱸塘鱧頭部和背部皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)在春季和冬季相對較多，腹部和尾部黏液細(xì)胞總數(shù)在冬季較多。(3)泥鰍皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于葛氏鱸塘鱧；泥鰍在不同季節(jié)其皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)不同，春季和夏季中皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)明顯多于秋季和冬季；葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞在冬季分布較多。

注：箭頭示黏液細(xì)胞；Ⅰ為Ⅰ型黏液細(xì)胞；Ⅱ?yàn)棰蛐宛ひ杭?xì)胞；Ⅲ為Ⅲ型黏液細(xì)胞；Ⅳ為 Ⅳ型黏液細(xì)胞;AB-PAS染色,下同Note: Arrows indicate mucous cells；Ⅰ，mucous cell Ⅰ； Ⅱ，mucous cell Ⅱ；Ⅲ，mucous cell Ⅲ；Ⅳ， mucous cell Ⅳ;AB-PAS staining，et sequentia圖1 4個(gè)季節(jié)泥鰍皮膚黏液細(xì)胞的顯微鏡觀察(100×20)Fig.1 Microscopic observation of mucous cells in skin of loach Misgurnus anguillicaudatus in four seasons (100×20)

表3 不同季節(jié)泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)

3 討論

3.1 泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞形態(tài)及類型的季節(jié)變化比較

本研究結(jié)果顯示，泥鰍在春夏兩季皮膚黏液細(xì)胞均以球狀Ⅳ型黏液細(xì)胞為主，在秋冬兩季均以囊狀Ⅱ型黏液細(xì)胞為主；而葛氏鱸塘鱧在4個(gè)季節(jié)中均以圓形或橢圓狀Ⅲ型黏液細(xì)胞為主，本試驗(yàn)中所采集的試驗(yàn)魚均來自東北高寒地區(qū)哈爾濱，因此，其所處的春夏季環(huán)境溫度明顯高于秋冬季。黃智慧等[10]研究表明，水體溫度的增加會導(dǎo)致水中病原微生物的活力增強(qiáng)，進(jìn)而對魚體構(gòu)成威脅，但隨著溫度升高，魚體皮膚表面分布的Ⅱ型和Ⅳ型黏液細(xì)胞分泌的酸性黏液成分也會隨之增加，可有效防止病原菌侵入魚體。因此，春夏兩季泥鰍體表黏液細(xì)胞中Ⅳ型黏液細(xì)胞所分泌的酸性黏多糖對泥鰍皮膚起到了很好的保護(hù)作用；此外，泥鰍在秋冬兩季皮膚中主要分布的是Ⅱ型黏液細(xì)胞，且其體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3種類型的黏液細(xì)胞，這一特征與魚體的保護(hù)機(jī)制相適應(yīng)。劉亞秋等[11]在關(guān)于消化道黏液細(xì)胞分布及發(fā)育的研究中也證實(shí)，在一定范圍內(nèi)黏液細(xì)胞的體積越大，其分泌黏液的能力越強(qiáng)，對魚體越有利。與泥鰍不同，葛氏鱸塘鱧體表黏液細(xì)胞多以Ⅲ型混合型黏液細(xì)胞為主，有資料顯示，牙鲆在最適生活溫度(21 ℃)下，其皮膚黏液抗體應(yīng)答強(qiáng)度才能達(dá)到最大[12]，說明環(huán)境溫度過低會對皮膚黏液抗體的產(chǎn)生起到一定的消極作用，進(jìn)而影響皮膚黏液細(xì)胞的類型分布，而葛氏鱸塘鱧是中國高寒地區(qū)的特色魚類，其所生活的環(huán)境多處于低溫狀態(tài)[13]，劉德明等[14]研究中也有相關(guān)報(bào)道，在魚類體表存在一個(gè)臨界溫度，當(dāng)?shù)陀谶@一臨界溫度時(shí)，黏液黏度隨溫度變化不明顯，這對于皮膚黏液細(xì)胞類型的分布也會產(chǎn)生一定的影響。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果還表明，泥鰍皮膚黏液細(xì)胞中含有較多的酸性黏多糖，而葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞中含有較多的中性黏多糖，這與陳楚等[15]的研究結(jié)果一致。泥鰍屬于鱗片退化魚類，其體表直接暴露于水環(huán)境中，因而容易受到水體中各種微生物的侵襲。張婷等[16]對魚類體表黏液分泌機(jī)制的研究表明，體表黏液中所含有的酸性物質(zhì)可以殺死魚類皮膚表面的寄生物，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用；國外也有研究發(fā)現(xiàn)，黏液細(xì)胞分泌的酸性黏多糖在免疫刺激中發(fā)揮著重要作用[17]；AB染色呈陽性的黏膜細(xì)胞比PAS染色呈陽性的黏膜細(xì)胞多，可能有利于保護(hù)黏膜免受微生物侵襲[18]。因此，泥鰍皮膚黏液細(xì)胞中含有的酸性黏多糖在抵抗外物侵襲的過程中發(fā)揮著不可替代的作用。而葛氏鱸塘鱧屬于有鱗魚類，其體表覆蓋鱗片，水體病原菌對其并不能構(gòu)成過多威脅，因而其皮膚黏液細(xì)胞含有較多的中性黏多糖，中性黏多糖主要具有黏著食物、促進(jìn)食物乳化等功能[19]。

3.2 泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)的季節(jié)變化比較

泥鰍和葛氏鱸塘鱧不同季節(jié)黏液細(xì)胞總數(shù)的比較結(jié)果顯示，泥鰍春夏兩季皮膚中含有大量的黏液細(xì)胞，且黏液細(xì)胞總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過秋冬兩季；而葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞在冬季分布較多。在一定范圍內(nèi)環(huán)境溫度越高，水中病原微生物的數(shù)量也會相應(yīng)增加，黏液細(xì)胞的數(shù)量會受到細(xì)菌感染的影響，在不利環(huán)境條件下魚類黏液分泌的增加是魚體內(nèi)存在的一種非特異性機(jī)制[20]，因此，泥鰍在春夏兩季中黏液細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)多于秋冬兩季，吳紅松[19]通過研究也證明，在不利環(huán)境的刺激之下，魚類機(jī)體會試圖利用黏液的抗菌作用以提高其對不利環(huán)境的免疫力；秋冬兩季泥鰍皮膚黏液細(xì)胞數(shù)量較少，還可能與泥鰍在低溫環(huán)境中食物獲取量的減少有關(guān)，在對鮭魚的研究顯示，食物不足會引起魚體表皮黏液細(xì)胞的密度迅速下降[21]。與泥鰍不同，葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞在冬季時(shí)分布相對較多，這可能與其在冬季時(shí)的生活習(xí)性及黏液的生理作用有關(guān)，曲麗華等[22]對葛氏鱸塘鱧生活習(xí)性的研究發(fā)現(xiàn)，葛氏鱸塘鱧是潛伏在水底泥土或水草叢生的泡沼里進(jìn)行冬眠，故其冬眠時(shí)身體周圍存在大量的耐低溫細(xì)菌和異物。陳超然[23]研究表明，黏液中有多種溶菌活性物質(zhì)存在，能夠抵御異物和病原體的侵襲，在機(jī)體防御中起著主要作用，這能夠很好地解釋冬季葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞數(shù)量較多的現(xiàn)象。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果還表明，泥鰍皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)，這可能與魚體鱗片的發(fā)達(dá)程度有關(guān)，鱗片不發(fā)達(dá)的魚類其黏液分泌量相對較大[24]。泥鰍身體上的鱗片細(xì)小，埋于皮下，鱗片大多退化[1]，而葛氏鱸塘鱧身體上的鱗片中等大小，頭和鰓蓋均有鱗片的分布[2]，因此，鱗片退化魚類泥鰍皮膚分布的黏液細(xì)胞總數(shù)要多于鱗片正常魚類葛氏鱸塘鱧，這與無鱗魚鲇及歐洲鰻鱺皮膚中含有大量的黏液細(xì)胞是相一致的[25-26]。楊淞等[27]在對無鱗魚似鲇高原鰍的研究中報(bào)道，底棲魚類長期生活在泥沙較多的水體底部，其體表分泌的大量黏液能夠使魚體保持清潔及潤滑，對于魚類體表而言十分重要，而泥鰍和葛氏鱸塘鱧同為底棲型魚類，其體表均會受到泥沙中異物的侵害，但由于葛氏鱸塘鱧皮膚表面有鱗片作為保護(hù)屏障，因而相比于泥鰍，葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細(xì)胞總數(shù)較少。