李東子，王嘯宇，徐銘，沈思思，丁小涵， 郭君寧，李俊成，張世杰，付晚濤、3*

(1.大連海洋大學 海洋科技與環(huán)境學院，遼寧 大連 116023; 2.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023;3.遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學與技術重點實驗室，遼寧 大連 116023)

人類進入工業(yè)化社會后，大量使用礦物質(zhì)燃料致使大氣CO2濃度升高，由工業(yè)化前(1860年代)約280 mg/L升高至目前約390 mg/L，而且仍以每年約0.5%速率繼續(xù)增長[1]，預計2100年和2300年大氣CO2濃度將分別達到1000、2000 mg/L[2]。作為全球最大碳泵，海洋以100萬t/h平均速率不斷從大氣中吸收CO2[3]，導致海水pH值降低[4-5]、海水碳酸鹽平衡改變，影響到海洋生物的生存。

依據(jù)海洋生物沉積物的元素可將海洋生物分為鈣質(zhì)生物和硅質(zhì)生物兩類[6-7]。海洋鈣質(zhì)生物主要有顆石藻、有孔蟲、翼足類軟體動物等，海洋硅質(zhì)生物主要有硅藻、放射蟲、硅鞭藻等[6]。大氣CO2濃度升高會導致海水pH降低，從而對海洋鈣質(zhì)生物產(chǎn)生負面影響，如距今2.52億年前海洋物種大滅絕就與古海洋酸化事件相關[8]。相對于海洋鈣質(zhì)生物，海洋硅質(zhì)生物受海洋酸化影響較小，因此，一直未引起人們重視，直到近十幾年才逐漸吸引研究者關注，如美國南加州大學Xu等[9]證實海洋酸化降低了南極硅藻Fragilariopsiscylindrus的生物硅含量，另有研究表明，大氣 CO2濃度升高影響繁茂膜海綿Hymeniacidonperlevis濾食海水中有機質(zhì)和細菌的功能[10-11]。

海綿是現(xiàn)存最低等的多細胞動物，生存在幾乎所有緯度、深度海水中，淡水中也有海綿生存[12]，因此，海綿在水域底棲生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用[13]。目前，地球上生存著大約15 000種海綿，在已經(jīng)命名的9000多種海綿中[14]，約90%屬于硅質(zhì)海綿，10%屬于鈣質(zhì)海綿[15]，兩種海綿分別由硅質(zhì)骨針和鈣質(zhì)骨針構成其骨架。海綿成骨細胞表達的硅酶將海水中可溶性硅酸鹽生物轉(zhuǎn)化成硅質(zhì)骨針[16]。因此，研究海綿硅酶基因的表達可以了解其對大氣 CO2濃度升高的最基礎分子響應，進而幫助人類認知海洋硅質(zhì)生物對大氣 CO2濃度升高的響應。

目前，有關大氣CO2濃度升高如何影響生物的研究主要集中在大氣CO2濃度升高環(huán)境下生物的響應，然而當大氣CO2濃度恢復至當前(約390 mg/L CO2)狀態(tài)下對生物基本功能的影響幾乎未知。因此，本研究中以廣泛分布于北黃海、渤海潮間帶海域的一種典型硅質(zhì)海綿——繁茂膜海綿[10-11]為模式生物，在實驗室條件下研究了大氣 CO2濃度升高對海綿硅酶基因表達的影響，隨后研究了大氣 CO2高濃度脅迫后海綿組織基本功能——濾食功能的變化，以期幫助認知海洋底棲典型硅質(zhì)生物對大氣CO2濃度升高的響應。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用繁茂膜海綿采自遼寧省大連市黑石礁潮間帶海域，將采集的海綿置于裝有海水的塑料袋中，0.5 h內(nèi)運回實驗室，在水族缸中暫養(yǎng)2 d后，從中篩選健康的海綿組織塊用于試驗[10-11]。新月菱形藻Natzchiaclosterum源于遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學與技術重點實驗室。海水取自遼寧省大連市黑石礁海域，經(jīng)沙濾、煮沸滅菌，稱為滅菌海水(SSW)。

試驗裝置采用發(fā)明專利——全球氣候變化背景下海洋潮間帶生態(tài)環(huán)境模擬系統(tǒng)及其應用(專利號：ZL 201210054111.1)[17]中的裝置與方法(以下簡稱“模擬生態(tài)系統(tǒng)”)，不同濃度CO2的制備參見文獻[18]中的方法。

試驗試劑Trizol、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、ExTaq DNA聚合酶、實時定量PCR試劑盒等購自寶生物工程( 大連) 有限公司，PCR 引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大氣CO2濃度升高對繁茂膜海綿壓力試驗 (1) 模擬大氣CO2濃度500 mg/L試驗。設5個模擬生態(tài)系統(tǒng)，每個系統(tǒng)分別裝有冷卻至室溫的滅菌海水25 L。第一和第二個模擬生態(tài)系統(tǒng)，用蠕動泵將空氣(CO2濃度約390 mg/L)泵入系統(tǒng)海水中[10]，其中第一個系統(tǒng)作為空白組不放海綿，第二個系統(tǒng)放入若干塊海綿組織塊(合計25.0 g)作為對照組。第三、四和五個模擬生態(tài)系統(tǒng)，分別置入若干塊海綿組織塊，每個系統(tǒng)中合計25.0 g，用蠕動泵將氣囊中氣體( CO2濃度500 mg/L)泵入系統(tǒng)的海水中[18]，作為試驗組1、2、3。為了保持試驗組CO2濃度穩(wěn)定在500 mg /L，每12 h更換1個氣囊(CO2濃度500 mg/L)。在試驗的12、24、48 h時，從對照組和試驗組1、2、3中分別隨機取出幾塊海綿組織塊，每塊切割一小塊海綿，合計約1.5 g海綿組織塊用于海綿硅酶表達分析，然后封閉模擬生態(tài)系統(tǒng)。在試驗開始和結(jié)束時，監(jiān)測模擬生態(tài)系統(tǒng)中海水的溫度和pH 值。

(2) 模擬大氣CO2濃度750和1000 mg/L試驗。除了試驗組1、2、3中分別使用CO2濃度750和1000 mg/L氣囊之外，其他與模擬大氣CO2濃度500 mg/L試驗相同。

1.2.2 海綿總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、硅酶基因表達

海綿總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及繁茂膜海綿硅酶基因定量表達按照文獻[16]中的方法操作。

硅酶表達的實時定量PCR引物：

Forword：5′CAGTGACGGCAAATCTAAAGG 3′；

Reverse：5′CCCATAGCACTAAAGGCATAGC 3′。

參比基因為繁茂膜海綿18S rRNA，引物為：

Forword：5′AGGAGATGCTCGCTGACTTC 3′;

Reverse：5′ CTCACCAGGTCCAGACATAG 3′。

1.2.3 高濃度CO2脅迫后海綿濾食微藻能力試驗 模擬大氣CO2濃度500、750、1000 mg/L試驗結(jié)束后，從對照組和試驗組1、2、3中取出海綿塊，分別置于各自水族缸中暫養(yǎng)1 h，然后從中隨機取出合計5.0 g海綿組織塊，置入預先裝有300 mL新月菱形藻液[密度為(105.5±8.6)×104cells/mL]的4個500 mL錐形瓶中，對應著“1.2.1節(jié)”試驗中的對照組和試驗組1、2、3。另設1個僅裝有300 mL相同密度新月菱形藻液的錐形瓶且不放海綿作為空白組。上述5個錐形瓶均不加入營養(yǎng)鹽，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(20 ℃、光照強度80 μmoL/(m2·s)、光暗周期12 h∶12 h)。在0、4、8、12、16、20、24 h，分別從錐形瓶中各取1.0 mL藻液，每次取3個平行，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)微藻密度。

1.2.4 海綿濾食微藻效率和清除率的計算 效率(filter rates，F(xiàn)R)和清除率(clearance rate，CR)分別直接和間接表征水生中濾食性動物尤其是海綿的過濾能力[15]，計算公式[10,15]為

FR=(C0-Ct)·V/(t·W)，

CR=ln(C0/Ct)·V/(t·W)。

其中：FR為過濾效率[cells/(h·g)]；CR為清除率[mL/(h·g)]；C0和Ct分別為初始和t時的微藻密度(104cells/mL)；V為錐形瓶中滅菌海水體積(300 mL)；t為時間(h)；W為海綿塊的鮮質(zhì)量(5.0 g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20 軟件進行方差分析，用t檢驗進行組間多重比較。采用ABI Real-time 分析軟件分析繁茂膜海綿硅酶基因的相對表達含量，具體參照文獻[19]，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬生態(tài)系統(tǒng)中海水溫度和pH的變化

試驗期間，海水溫度為17～21 ℃?？瞻捉M海水pH變化范圍為8.05～8.15，對照組pH為8.06～8.15，模擬大氣CO2濃度為500、750、1000 mg/L的試驗組pH分別為7.90～7.97、7.73～7.80、7.56～7.63。空白組和對照組的海水pH幾乎無差異，這表明，試驗期間在模擬生態(tài)系統(tǒng)中放入海綿未影響海水pH。隨著模擬生態(tài)系統(tǒng)中大氣CO2濃度升高，海水pH呈降低趨勢。

2.2 大氣CO2濃度升高后海綿硅酶基因表達變化

從圖1可見：對照組(390 mg/L CO2)海綿硅酶基因相對表達量在12、24、48 h間無顯著性差異(P>0.05)；在模擬大氣CO2濃度500 mg/L條件下，試驗組海綿硅酶相對表達量在12、24、48 h分別比對照組顯著提高24.8%、14.8%和19.2%(P<0.05)；在大氣CO2濃度750、1000 mg/L條件下，試驗組海綿硅酶基因相對表達量在12、24、48 h分別比對照組顯著降低40.0%、71.9%、82.3%(750 mg/L CO2)，55.2%、83.6%、80.8%(1000 mg/L CO2)?？梢?，大氣CO2濃度為500 mg/L時可促進繁茂膜海綿硅酶基因表達，而大氣CO2濃度為750、1000 mg/L時則嚴重抑制海綿硅酶基因表達。

此外，390 mg/L CO2的對照組和500 mg/L CO2試驗組，海綿硅酶基因表達量隨作用時間延長無顯著性變化(P>0.05)；而750、1000 mg/L CO2試驗組，隨著作用時間延長基因表達量顯著降低(P<0.05)，24、48 h時硅酶基因表達量僅分別為12 h的48.0%、30.7%(750 mg/L CO2)，37.5%、44.6%(1000 mg/L CO2)。

注：標有不同小寫字母者表示同一時間不同濃度組間有顯著性差異(P<0.05);標有不同大寫字母者表示同一濃度不同時間點間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)Note:The means with different letters in the same time are significantly different among different CO2 concentration groups at the 0.05 probability level, means with different capital letters in same concentration are significantly different in different time at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences圖1 不同大氣CO2濃度下繁茂膜海綿硅酶基因表達變化Fig.1 Changes in silicatein gene expression of marine sponge Hymeniacidon perlevis exposed to different concentrations of CO2

2.3 高濃度CO2脅迫后海綿濾食微藻能力的變化

不同高濃度大氣CO2脅迫后海綿組織塊的濾食能力有顯著變化。從圖2-A可見：各組新月菱形藻初始平均密度為(105.5±8.6)×104cells/mL，空白組(未放入海綿組織塊)微藻密度隨作用時間延長無顯著性差異(P>0.05)；對照組和500 mg/L CO2試驗組海綿組織塊濾食微藻的能力相近，在24 h時兩組中的微藻密度分別為(26.2±7.8)×104、(22.4±1.8)×104cells/mL，分別為微藻初始密度的24.8%和21.2%，相應地，在24 h內(nèi)對照組和500 mg/L CO2組海綿組織塊濾食微藻的平均效率分別為198.2×104、207.8×104cells/(h·g)；750 mg/L CO2組海綿塊濾食微藻速率低于對照組，在24 h時微藻密度為(59.1±4.8)×104cells/mL，分別為初始微藻密度和對照組的56.0%、2.26倍，相應地，在24 h內(nèi)海綿濾食微藻的平均效率為116.0×104cells/(h·g)，比對照組降低41.5%；1000 mg/L CO2組海綿塊濾食微藻速率進一步降低，在24 h時微藻密度為(81.1±4.8)×104cells/mL，分別為初始微藻密度和對照組的76.9%、3.09倍，相應地，在24 h內(nèi)海綿濾食微藻平均效率為61.0×104cells/(h·g)，比對照組降低69.2%?？梢?，大氣CO2濃度為750、1000 mg/L時不但抑制繁茂膜海綿硅酶基因表達，而且實質(zhì)性地損害了海綿塊濾食微藻的基本功能。

從圖2-B可見：除4、8 h時間點不同之外，對照組(390 mg/L)與500 mg/L CO2試驗組海綿塊濾食微藻的清除率變化趨勢基本一致，在24 h內(nèi)對照組和500 mg/L CO2試驗組海綿塊的平均清除率分別為4.09、3.95 mL/(h·g)；750 mg/L CO2試驗組海綿塊清除率顯著低于對照組，在24 h內(nèi)海綿塊平均清除率為2.67 mL/(h·g)，比對照組降低34.7%，且其清除率隨時間延長而逐漸下降；1000 mg/L CO2試驗組海綿塊清除率進一步降低，在24 h內(nèi)其海綿塊平均清除率為0.82 mL/(h·g)，比對照組降低79.9%，海綿幾乎喪失濾食微藻的基本功能。

圖2 不同濃度大氣CO2脅迫后各組海綿濾食微藻能力的變化Fig.2 Changes in filtering ability of marine sponge Hymeniacidon perlevis exposed to different concentration of CO2 in various groups

3 討論

3.1 高濃度大氣CO2對海綿硅酶基因表達的影響

海綿是固著生長的多細胞動物，只能被動適應環(huán)境變化[15]。海綿由形狀各異、大小不同的骨針構成海綿骨架，海綿的成骨細胞分泌軸絲蛋白將海水中可溶性硅酸鹽或可溶性鈣鹽生物合成為硅質(zhì)骨針或鈣質(zhì)骨針，其中，合成硅質(zhì)骨針的軸絲蛋白稱為硅酶[16]。目前，已經(jīng)鑒定的9000多種海綿中有90%屬于硅質(zhì)海綿，因此，海綿硅酶表達量的變化可以代表海洋底棲硅質(zhì)生物對生態(tài)環(huán)境變化的基本響應。

本研究中，大氣CO2濃度升高至500 mg/L時，在12、24、48 h時試驗組海綿硅酶表達量均顯著高于對照組(390 mg/L CO2)(圖1)，說明繁茂膜海綿在此環(huán)境下利用海水中可溶性硅酸鹽的效率有所提高，海綿成骨細胞增加分泌硅酶以生物合成更多骨針，為海綿生物量增加提供了基本骨架。此結(jié)果與大氣CO2濃度為500 mg/L時增強了繁茂膜海綿濾食海水中有機碳能力的結(jié)果相符合[10]，且與低光照協(xié)同海洋酸化環(huán)境促進中國南海硅藻生長的結(jié)果相似[20]，這意味著大氣CO2濃度從目前約390 mg/L升高至500 mg/L時將會促進海洋硅質(zhì)生物的生長。目前，大氣CO2濃度為500 mg/L時負面影響海洋鈣質(zhì)生物已經(jīng)被一些研究證實[21-22]，因此，本研究中展示的大氣CO2濃度為500 mg/L時促進海洋硅質(zhì)生物生長的研究結(jié)果更具參考價值。

本研究中大氣CO2濃度升高至750、1000 mg/L時，試驗組海綿硅酶基因表達量呈逐漸下降趨勢(圖1)，在12、24、48 h時，750 mg/L CO2濃度組海綿硅酶表達量分別比500 mg/L CO2濃度組對應時間下降了51.9%、75.5%和85.2%，1000 mg/L CO2濃度組海綿硅酶表達量進一步下降，分別比500 mg/L CO2濃度試驗組對應時間下降了64.1%、85.7%和83.9%。已有研究表明，大氣CO2濃度為750、1000 mg/L時顯著抑制了繁茂膜海綿濾食海水中有機碳[10]和細菌[11]的功能，在海綿基本濾食功能減弱后，繁茂膜海綿硅酶基因表達降低應為海綿正常的生理反應。可見，大氣CO2濃度從500 mg/L升高至750 mg/L以上時，抑制了繁茂膜海綿硅酶基因的表達和基本濾食功能，對海洋鈣質(zhì)生物和海洋硅質(zhì)生物均會產(chǎn)生負面影響，此時海洋生態(tài)系統(tǒng)將遭到嚴重破壞。

3.2 高濃度大氣CO2脅迫后海綿濾食微藻功能的恢復情況

隨著極端氣象條件不斷出現(xiàn)，沿岸污染事件頻繁發(fā)生，尤其工業(yè)污染導致的近海海洋酸化局域性頻發(fā)，在黃、渤海潮間帶生態(tài)系統(tǒng)占有重要地位的繁茂膜海綿在遭遇短時間海水酸化后能否保持其基本濾食功能是學界關注的重點。本試驗中，對照組海綿樣品在當前大氣CO2濃度(390 mg/L CO2)下，海綿塊保持了較高的濾食微藻的能力，在24 h內(nèi)海綿濾食新月菱形藻的平均效率為198.2×104cells/(h·g)，此數(shù)值與繁茂膜海綿濾食大腸桿菌(EscherichiacoliAS 1.1017)的效率相當[23]，但比一種地中海海綿ChondrillanuculaSchmidt濾食大腸桿菌的效率高出幾百倍[24]，這應與海綿種屬和濾食對象(微藻、大腸桿菌)的差異有關。同樣地，24 h內(nèi)對照組海綿濾食微藻的平均清除率為4.09 mL/(h·g)，這僅為繁茂膜海綿濾食大腸桿菌清除率的10%左右[23]，但高于地中海海綿濾食大腸桿菌的清除率數(shù)倍[24]，造成此差異的原因是試驗用海綿樣品的水溝系結(jié)構性不同[25]。經(jīng)500 mg/L大氣CO2脅迫48 h再于當前大氣CO2濃度(390 mg/L CO2)下恢復1 h后，海綿樣品濾食微藻的效率和清除率與對照組相近，而經(jīng)750、1000 mg/L CO2濃度脅迫及當前大氣CO2下恢復后，海綿樣品濾食微藻的效率與清除率呈逐漸下降趨勢，24 h內(nèi)海綿塊濾食微藻的平均效率與平均清除率分別僅為對照組的58.5%、65.3%(750 mg/L CO2)，30.8%、20.0%(1000 mg/L CO2)(圖2)?？梢?，經(jīng)濃度為750、1000 mg/L大氣CO2脅迫后，海綿樣品的濾食能力大幅度降低。此結(jié)果與本研究中大氣CO2濃度升高對繁茂膜海綿硅酶基因表達的結(jié)果在機理上相互印證。

本研究中，在大氣CO2濃度為750、1000 mg/L時，隨著CO2濃度升高和海洋酸化壓力時間延長，繁茂膜海綿硅酶基因相對表達量顯著降低，但最終會穩(wěn)定在某一水平，這表明在海洋酸化壓力下海洋鈣質(zhì)生物可能會逐漸滅絕，但海洋硅質(zhì)生物可能會維持在一個較低生物量水平。此判斷與距今2.52億年前古海洋酸化導致海洋物種大滅絕相符合[8]，同時也與淺海CO2噴口處海水pH低導致生物量明顯減少、生物多樣性明顯降低的結(jié)果相符合[26]。這預示著如果大氣CO2濃度升高至1000 mg/L以上甚至更高時，未來海洋生態(tài)系統(tǒng)中的鈣質(zhì)生物和硅質(zhì)生物均將大幅度減少，其中海洋硅質(zhì)生物仍能維持生存，但是否可長期生存需要進一步研究。

4 結(jié)論

(1)大氣CO2濃度由目前約390 mg/L升高至500 mg/L時，可促進繁茂膜海綿硅酶基因表達， CO2濃度繼續(xù)升高至750、1000 mg/L時，則抑制海綿硅酶基因表達，且隨著作用時間延長，海綿硅酶基因表達也隨之降低。(2)海綿樣品經(jīng)不同濃度大氣CO2脅迫后，在當前大氣CO2濃度下其濾食微藻的功能差異明顯，經(jīng)濃度為500 mg/L大氣CO2脅迫后，海綿塊與對照組幾乎無差異(除了試驗初始2個采樣時間點外)，經(jīng)濃度為750 mg/L大氣CO2脅迫后，海綿塊濾食功能嚴重受損，而經(jīng)濃度1000 mg/L CO2脅迫后，海綿塊幾乎喪失了濾食微藻功能。此研究結(jié)果對人類認知大氣CO2濃度升高對海洋硅質(zhì)生物的影響提供了數(shù)據(jù)參考。