張文新 林衛(wèi)萍 孫楠 高飛 孫晶 黃杰★ 曲守方★

遺傳性血紅蛋白疾患，包括地中海貧血和鐮狀細(xì)胞疾病，是全球最常見的單基因病之一。地中海貧血是一種人類單基因疾病，根據(jù)致病機制的不同，分為α-地中海貧血以及β-地中海貧血［1-2］。α-地中海貧血由位于16 號染色體上的α珠蛋白基因發(fā)生缺失、插入、突變、重排等因素導(dǎo)致，β-地中海貧血由位于11 號染色體上的β 珠蛋白基因缺失、插入、突變、重排等因素導(dǎo)致，基因變異導(dǎo)致α 與β 珠蛋白基因的不平衡表達(dá)，是形成地中海貧血的主要病因［3-6］。

產(chǎn)前基因篩查是目前預(yù)防地中海貧血的主要手段。地中海貧血（α/β 型）基因檢測試劑盒的原理是基于液相懸浮陣列技術(shù)（suspension array），即國內(nèi)常稱的液相芯片。它的核心技術(shù)就是采用被編碼的微球取代了常規(guī)基因芯片的固相載體，每個檢測用的具有生物識別功能的分子對應(yīng)一種編碼的微球，可以在一個體系實現(xiàn)多種基因突變位點檢測。它具有生物芯片的高通量、高集成、微型化、連續(xù)化和自動化等優(yōu)點，還具有液相反應(yīng)的高敏感性、高重復(fù)性、檢測線性范圍寬、反應(yīng)快速等優(yōu)點，并且該方法操作簡便、快捷、樣品用量少。其檢測原理示意圖。見圖1、圖2。

本研究使用液相芯片技術(shù)對來自中國食品藥品檢定研究院提供的地中海貧血核酸檢測國家參考品進(jìn)行檢測，用于評價該技術(shù)方法試劑盒的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 研究對象

中國食品藥品檢定研究院提供的32 例地中海貧血核酸檢測國家參考品的DNA。

1.2 儀器與試劑

Applied Biosystems Veriti Dx 熱循環(huán)儀購自美國賽默飛世爾科技公司；Luminex Magpix 儀器購自美國Luminex 公司；地中海貧血（α/β 型）基因檢測試劑盒（PCR-流式熒光雜交法）由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供；地中海貧血核酸檢測國家參考品由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理

將樣本稀釋至12.5 ng/μL，嚴(yán)格按地中海貧血（α/β 型）基因檢測試劑盒（PCR-流式熒光雜交法）說明書進(jìn)行PCR 擴增、雜交、顯色等步驟。

1.3.2 檢測

具體操作為：①運行xponet4.2 軟件，打開Plate Heater，使之加熱到55℃。②打開Samples 選項，點擊Create New Samples 輸入樣品信息。③將孵育后的反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到Magpix 設(shè)備上，并點擊“run”讀取Net MFI。

1.3.3 結(jié)果判讀

根據(jù)試劑盒說明書對檢測結(jié)果進(jìn)行判讀。

2 結(jié)果

2.1 野生型位點信號值以及N/M 值分布情況（非缺失型）

野生型位點信號值以及N/M 值分布情況（非缺失型）。見表1。所有野生型位點檢測結(jié)果均與國家參考品結(jié)果一致。

2.2 陽性位點信號值以及N/M 值分布情況（非缺失型）

陽性位點信號值以及N/M 值分布情況（非缺失型）結(jié)果見表2。各位點雜合位點比值在0.76～1.77 之間，純合型位點比值在0.06～0.07 之間；各位點N/M 比值均落在相應(yīng)的雜合或純合區(qū)間。經(jīng)統(tǒng)計，所有陽性位點檢測結(jié)果均與國家參考品結(jié)果一致。

2.3 缺失型信號值分布情況

缺失型樣本信號值分布情況見表3。所有缺失樣本檢測結(jié)果均與國家參考品型別一致。

2.4 不同型別樣本與微球信號值關(guān)系（非缺失型）

以IVS-II-654 位點為代表，不同型別檢測結(jié)果見圖3。

編碼為52 號的微球偶聯(lián)了IVS-II-654 位點野生型探針（N 探針），編碼為62 號的微球偶聯(lián)了IVS-II-654 位點突變型探針（M 探針）。對于IVS-II-654 位點野生型樣本，52 號微球產(chǎn)生信號值遠(yuǎn)大于62 號微球；對于IVS-II-654 位點雜合型樣本，52號微球產(chǎn)生信號值與62 號微球信號值差異不大；對于IVS-II-654 位點純合型樣本，52 號微球產(chǎn)生信號值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于62 號微球。

表1 樣本野生型位點檢測結(jié)果（非缺失型）Table 1 Results of wild type loci in samples（non-deletion genetype）

表2 樣本陽性位點檢測結(jié)果（非缺失型）Table 2 Results of mutant type loci in samples（non-deletion genetype）

表3 樣本檢測結(jié)果（缺失型）Table 3 Results of samples（deletion genetype）

2.5 不同型別樣本與微球信號值關(guān)系（缺失型）

以4.2 缺失位點為代表，不同型別檢測結(jié)果見圖4。

編碼為57 號的微球偶聯(lián)了4.2 缺失型探針（4.2 探針），編碼為72 號的微球偶聯(lián)了缺失野生型探針（α2 探針）。對于缺失野生型樣本，72 號微球產(chǎn)生信號值遠(yuǎn)大于57 號微球；對于4.2 缺失雜合型樣本，57 號微球產(chǎn)生信號值與72 號微球信號值差異不大；對于4.2 缺失純合型樣本，57 號微球產(chǎn)生信號值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于72 號微球。

3 討論

地中海貧血主要是由珠蛋白基因異常引起的。世界上約有4.83%的人口攜帶珠蛋白變異基因，我國發(fā)病率較高的廣西、廣東人群中地中海貧血基因攜帶率為12.22%～23.02%。目前該病尚無有效的治療方法，因此遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷以及在我國南方開展大人群的分子篩查作為防治該疾病的首要途徑，對控制重型地貧患兒的出生，提高出生人口素質(zhì)具有重要意義［7-10］。

基因檢測在地中海貧血的預(yù)防中發(fā)揮了極其重要的作用。目前臨床基因檢測手段主要有反向點雜交法、跨越斷裂點PCR 法（Gap-PCR）等。反向點雜交法可用時對未知樣本中多個突變進(jìn)行篩查大大提高了診斷效率。但缺點是操作繁瑣?？缭綌嗔腰cPCR 法，主要用于α 地貧的基因診斷，其缺陷就是只能診斷缺失大片段缺失型樣品而不能診斷點突變，且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

本研究基于液相芯片的技術(shù)特點，將20 個點突變位點的野生型探針以及突變型探針分別偶聯(lián)到40 個具有特殊編碼的微球中；將4 種缺失探針（3.7，4.2，SEA，α2）偶聯(lián)到4 種具有特殊編碼的微球中，同時設(shè)置一個微球用于質(zhì)控。在含45 種微球的雜交體系中，利用液相芯片技術(shù)，設(shè)備將每種微球的信號一一計算，并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，經(jīng)過運算快速實現(xiàn)了分型目的。

根據(jù)對地中海貧血核酸檢測國家參考品中32例樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：對于非缺失型，不同型別位點的N/M 值有顯著差異。以CD41-42 位點為例，共計檢測到30 例該位點野生型的樣本、1 例該位點雜合型樣本、1 例該位點純合型樣本。其中30 例野生型標(biāo)本的N/M 值均大于或等于7.8，1 例雜合型標(biāo)本的N/M 值為1.32，1 例純合型樣本比值為0.06。結(jié)果表明，利用液相芯片平臺，可以顯著區(qū)分三種型別的樣本，并且利用N/M 值這種判讀方式，可以顯著修正因樣本加樣量增加、樣本濃度波動等導(dǎo)致的背景信號、非特異信號升高等對結(jié)果的干擾，使檢測結(jié)果準(zhǔn)確率大大提高。對于缺失型，使用α2 探針作為內(nèi)控，α2 與其余三種探針相互校驗，可區(qū)分雜合缺失、純合缺失、雙重缺失以及缺失野生型。

本研究對地中海貧血核酸檢測國家參考品中32 例樣本進(jìn)行檢測，國家參考品的型別包括7 種α-地中海貧血基因突變類型以及18 種β-地中海貧血基因突變類型。在這32 例國家參考品中，3 例樣本已知為野生型，6 例樣本已知為試劑盒檢測范圍外位點陽性，23 例為試劑盒檢測范圍內(nèi)位點陽性。經(jīng)檢測，試劑盒的結(jié)果符合國家參考品的預(yù)期結(jié)果，試劑盒檢測范圍內(nèi)的國家陽性參考品均為相應(yīng)基因型別，試劑盒檢測范圍內(nèi)的國家陰性參考品均為野生型，準(zhǔn)確性達(dá)100%。針對6 例試劑盒檢測范圍外位點陽性的國家參考品，因本試劑盒并未設(shè)計這些位點的相應(yīng)探針，故無檢測數(shù)據(jù)輸出，對這些位點是否突變陽性并不進(jìn)行判讀；但對于試劑盒檢測范圍內(nèi)的位點，其檢測結(jié)果均為野生型，符合國家參考品的預(yù)期結(jié)果。

本研究局限性在于無法檢測一些罕見地貧大片段缺失，如泰國型（--THAI），中國型（Gγ+（Aγδβ）0），東南亞型（SEA-HPFH），以及一些罕見堿基轉(zhuǎn)換，如Codon37（TGG＞TAG），-90（C＞T）。針對目前罕見的大片段缺失，采用的方法通常為Gap-PCR 法，操作繁瑣，且較容易污染［11-13］。進(jìn)一步開發(fā)基于液相芯片法的試劑覆蓋上述檢測位點有利于推動地中海貧血產(chǎn)前篩查的普及率。

基于液相芯片技術(shù)的的地中海貧血（α/β 型）基因檢測試劑盒，能夠滿足我國地中海貧血核酸檢測國家參考品的要求，具有很好的質(zhì)量，為地中海貧血基因檢測提供了一種可靠的檢測方法。