董艷迎 李妙羨 朱建宏 孟昊 劉海龍 張華 高寧 張磊 黨雙鎖 耿燕

新型冠狀病毒肺炎，正式名稱(chēng)為2019 冠狀病毒病（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒，即嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的急性感染性肺炎，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳，部分患者可發(fā)展為嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合癥、膿毒癥休克及多器官功能衰竭等［1-2］。截止到2020年4月12日，全球范圍內(nèi)共有1 696 588 例確診感染SARS-CoV-2，死亡人數(shù)105 952 例，其中中國(guó)感染人數(shù)83 482例，死亡人數(shù)3 349 例，其中危重型病例病死率極高［3］。目前對(duì)于SARS-CoV-2 導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎致病機(jī)制尚未完全闡明。但越來(lái)越多的證據(jù)支持SARS-CoV-2 致病是免疫介導(dǎo)的病理反應(yīng)。免疫細(xì)胞功能紊亂和過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是造成多器官損傷的主要原因［4-6］。本研究對(duì)6 例新型冠狀病毒肺炎患者的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性研究，分析其免疫功能指標(biāo)T 淋巴細(xì)胞亞群及多種細(xì)胞因子的變化規(guī)律，將有助于進(jìn)一步探索COVID-19 致病機(jī)制，為臨床開(kāi)展COVID-19 早期預(yù)警和病情判斷提供潛在的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年1月至2020年3月在本院住院的6 例新型冠狀病毒肺炎患者。選取本院健康體檢者10 例為正常對(duì)照。6 例COVID-19 患者男性3例，女性3 例，年齡為（51.17±13.78）歲；10 例健康對(duì)照患者男性、女性各5 例，年齡為（49.7±11.61）歲，COVID-19 病例組與正常對(duì)照組間年齡、性別比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。所有新型冠狀病毒肺炎確診病例診斷標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳同期發(fā)布的“新型冠狀病毒肺炎診療方案”［7］。本研究所涉及研究對(duì)象均已出院，主要利用患者的病例資料進(jìn)行回顧性分析，未對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行干預(yù)行為，未涉及和侵犯患者的個(gè)人隱私和權(quán)益。

1.2 方法

通過(guò)本院電子病例系統(tǒng)提取患者性別、年齡、流行病學(xué)史及診斷等資料。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)提取患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果的原始資料，主要觀察指標(biāo)包括：血常規(guī)、凝血、心臟肝腎功能、血細(xì)胞沉降率、C 反應(yīng)蛋白和降鈣素原等檢查指標(biāo)。COVID-19 患者免疫功能的評(píng)估包括利用Beckman coulter 流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者T 淋巴細(xì)胞亞群及利用西門(mén)子Immulite 1000 化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)患者多種炎癥因子的變化。所有實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)采集當(dāng)日各項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控均在控。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間差異分析采用兩組獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)；對(duì)不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以四分位間距表示，兩組間差異分析采用兩獨(dú)立樣本資料秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新型冠狀病毒肺炎患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析

新型冠狀病毒肺炎患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）。COVID-19 患者ESR、FIB、D-D、肝功能檢驗(yàn)指標(biāo)ALT 和AST、腎功能檢測(cè)指標(biāo)CysC 和急性心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、HBDH均較正常對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）。COVID-19 患者PCT 正常，CRP 較正常對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）（表1）。

2.2 新型冠狀病毒肺炎患者免疫功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析

T 淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示CD3+T、CD4+T 及CD8+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）。COVID-19 患者CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示COVID-19 患者炎癥因子IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 均較正常對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）（圖1和圖2）。

表1 新型冠狀病毒肺炎患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果［（±s），四分位間距］Table 1 Laboratory data of COVID-19 patients［（±s），四分位間距］

表1 新型冠狀病毒肺炎患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果［（±s），四分位間距］Table 1 Laboratory data of COVID-19 patients［（±s），四分位間距］

注：正常對(duì)照&COVID-19 患者間比較：aP＜0.05；bP＜0.01；cP＜0.001；dP＜0.000 1；1統(tǒng)計(jì)值為Mann-Whitney U 值。

項(xiàng)目白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC，×109/L）中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT#，×109/L）淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMP#，×109/L）紅細(xì)胞沉降率（ESR，mm/h）纖維蛋白原（FIB，mg/dL）D-二聚體（D-D，μg/L）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，IU/L）谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，IU/L）尿素（UREA，mmol/L）血肌酐（CREA，μmol/L）胱抑素C（CysC，mg/L）乳酸脫氫酶（LDH，IU/L）羥丁酸脫氫酶（HBDH，IU/mL）降鈣素原（PCT，ng/mL）C-反應(yīng)蛋白（CRP，mg/L）正常對(duì)照（n=10）5.72±0.93 3.35±0.78 1.81±0.42 5.70±3.20 247.44±49.33 100～150 10～23.25 21.1±4.41 5.04±1.41 56.24±11.44 0.804±0.11 175.3±31.23 117.1±26.74 0.05～0.07 3.14～3.57 COVID-19 患者（n=6）7.45±4.79 4.97±3.23 0.84±0.46d 46.5±12.34d 441.2±104.9c 412.5～5970c 56.67±51.88a 51.33±32.71a 4.85±2.62 46.53±18.18 1.09±0.37a 310±190.8a 200.2±117.8a 0.08～0.24 47.84±38.72b t/Mann-Whitney U 1.14 1.55 4.29 10.12 4.86 01 2.31 2.95 0.15 1.32 2.30 2.23 2.19 4.51 7.51 P 值0.28 0.14 0.0008 0.0008 0.0003 0.0004 0.037 0.011 0.88 0.21 0.038 0.04 0.046 0.003 0.0096

3 討論

COVID-19 患者發(fā)病早期外周血白細(xì)胞總數(shù)正常，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，其降低程度提示COVID-19患者免疫功能低下。凝血功能指標(biāo)FIB 和D-二聚體增高，有研究表明危重型COVID-19 患者體內(nèi)存在高凝狀態(tài)，抗磷脂抗體可加重患者的凝血異常，增高患者血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［8-9］，白細(xì)胞及凝血系統(tǒng)的改變對(duì)新型冠狀病毒肺炎的診斷及病情判斷具有一定的參考價(jià)值［10］。根據(jù)目前的尸檢和穿刺組織病理檢查結(jié)果顯示COVID-19 患者存在廣泛的多器官損傷，包括肺臟、脾臟、心臟、血管、肝臟、膽囊、腎臟表現(xiàn)出不同程度的實(shí)變［11］。本研究中COVID-19 患者與對(duì)照組相比，心、肝及腎功能損傷指標(biāo)均有不同程度的增高?；颊逤RP 和ESR 升高，PCT 正常提示新冠病毒感染后COVID-19 患者體內(nèi)存在急性炎癥反應(yīng)，這些常規(guī)炎癥指標(biāo)的升高程度反映炎癥組織的大小及疾病的活動(dòng)性，持續(xù)的升高提示病情加重、治療失敗和預(yù)后差。

機(jī)體感染新冠病毒后，固有免疫在早期抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用，這也是輕癥患者能夠痊愈的主要原因。T 淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CD8+T 細(xì)胞）在抗病毒感染免疫及免疫病理?yè)p傷中起重要作用，輔助型T 細(xì)胞（CD4+T 細(xì)胞）在免疫調(diào)節(jié)功能中起重要作用，當(dāng)不同T 淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，機(jī)體可發(fā)生免疫功能紊亂而導(dǎo)致一系列病理變化［4，12，13］。在我們的分析中發(fā)現(xiàn)COVID-19 患者CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞均顯著降低，提示機(jī)體感染新冠病毒后，免疫功能處于低下及抑制狀態(tài)。COVID-19 患者體內(nèi)IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 水平較對(duì)照組顯著增高，是新冠肺炎患者病情加重及預(yù)后不良的重要指標(biāo)。新冠病毒感染后，引起機(jī)體免疫應(yīng)答的同時(shí)，也活化了各種細(xì)胞信號(hào)，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放，引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。炎癥因子的釋放是一種應(yīng)激反應(yīng)，一方面有利于病毒清除，然而失控的炎癥反應(yīng)和免疫紊亂會(huì)引起多器官免疫病理?yè)p傷［14］。IL-6 受體抑制劑托珠單抗抑制COVID-19 患者炎癥因子風(fēng)暴已在新冠肺炎的臨床治療中得到大力推廣，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞因子風(fēng)暴是重癥新冠肺炎一個(gè)重要的致病因素［15］。由于本研究為單中心研究，樣本數(shù)量的限制可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏倚，后續(xù)需進(jìn)行更大規(guī)模的多中心研究佐證我們的結(jié)果是非常必要的。

新型冠狀病毒感染的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素的復(fù)雜過(guò)程。T 淋巴細(xì)胞的進(jìn)行性下降和細(xì)胞因子風(fēng)暴的出現(xiàn)是COVID-19 患者重要的免疫學(xué)特征，動(dòng)態(tài)觀察COVID-19 患者各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室及免疫功能指標(biāo)對(duì)評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)、早期識(shí)別機(jī)體炎癥狀態(tài)及監(jiān)測(cè)療效均具有重要意義。