冼嘉嘉 何健淳 王燕超 李少英 何文智 馬曉燕 葉國(guó)新 黎青 曾軍

地中海貧血（地貧，thalassemia）是一種由于珠蛋白基因突變或者缺失導(dǎo)致的珠蛋白鏈合成減少或完全缺失所引起的遺傳性慢性溶血性疾?。?］。其中，α-地貧由α-珠蛋白基因缺陷所致，根據(jù)基因改變類型的不同，α-地貧可分為缺失型和非缺失型，前者是由于珠蛋白基因大片段缺失所致，是主要的突變類型，后者是由于僅珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)序列發(fā)生點(diǎn)突變?cè)斐傻模?-2］。廣東作為地貧高發(fā)地區(qū)之一，地貧發(fā)病率達(dá)9.46%［3］，目前對(duì)于廣州地區(qū)非缺失型α-地貧基因檢測(cè)的報(bào)道仍然較少。本研究旨在了解該地區(qū)的非缺失型α-地貧的基因突變類型和構(gòu)成比，以及相對(duì)應(yīng)的臨床和血液學(xué)特征，為明確非缺失型α-地貧的診斷指標(biāo)，完善本地區(qū)的非缺失型α-地貧篩查提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年7月至2019年6月在本院進(jìn)行地貧基因檢測(cè)的患者共27 502 例，其中男性12 485 例，年齡0～83 歲；女性15 017 例，年齡0～79 歲，均為廣州地區(qū)患者。本研究選取其中明確診斷為非缺失型α 地貧的307 例患者作為研究對(duì)象，所有病例均排除缺鐵，α 復(fù)合β-地貧和異常血紅蛋白病。所有患者及家屬均已簽署知情同意書。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

血細(xì)胞分析儀（NX-9000，Sysmex，日本），全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀（Capillarys 2 Flex Piercing，Sebia，法國(guó)），離心機(jī)（Eppendorf 5240，德國(guó)），PCR 擴(kuò)增儀（ABI9700，美國(guó)），凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-rad，美國(guó)），水平電泳槽及電泳儀（Bio-rad，美國(guó)），恒溫水浴箱。

1.2.2 試劑

全血基因組DNA 提取試劑盒（QIAGEN，德國(guó)），地貧基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，試劑均為廠家原裝配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 血細(xì)胞分析

采用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血細(xì)胞分析，送檢樣本在4 h 內(nèi)完成檢測(cè)。主要觀察指標(biāo)為HGB、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）。

1.3.2 血清鐵和血清鐵蛋白分析

采用化學(xué)比色法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法分別用于血清鐵（serum iron，SI）和血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）的測(cè)定。

1.3.3 血紅蛋白電泳

嚴(yán)格按照Capillarys 2 Flex Piercing 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀的說(shuō)明書進(jìn)行操作，分析樣本各血紅蛋白組分的含量。

1.3.4 基因型分析

以DNA 提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取基因組DNA。采用跨越斷裂點(diǎn)PCR（gap polymerase chain reaction，Gap-PCR）技術(shù)檢測(cè)3 種缺失型α-地貧基因突變類型（--SEA、-α3.7和-α4.2），采用PCR 結(jié)合反向雜交（PCR-reverse dot blot，PCR-RDB）技術(shù)檢測(cè)非缺失型α-地貧基因3 種常見(jiàn)突變類型（ααWS，ααCS和ααQS），所有地貧基因診斷試劑盒均購(gòu)于亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（）表示，比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）及t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非缺失α-地貧基因型檢測(cè)結(jié)果

在27 502 受檢者中，檢出307 例非缺失型α-地貧，非缺失型α-地貧的發(fā)生率為1.12%。307例非缺失型α-地貧中以ααWS/αα 最為常見(jiàn)，占44.63%，此外，在--SEA/ααT患者中，也以復(fù)合Hb WS最為常見(jiàn)，占6.51%，見(jiàn)表1。

表1 307 例非缺失型α-地貧基因型分布情況［n（%）］Table 1 Distribution of non-deletion α-Thalassemia genotype in 307 cases［n（%）］

2.2 常見(jiàn)非缺失型α-地貧血液學(xué)特征分析

3 種常見(jiàn)非缺失型α-地貧的雜交膜條結(jié)果（圖1），血常規(guī)及血紅蛋白電泳結(jié)果（圖2）。男性ααWS/αα 組、ααCS/αα 組和ααQS/αα 組與男性對(duì)照組相比較，MCV、MCH 水平均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MCV：F=83.95，P＜0.05；MCH：F=153.54，P＜0.05）。女性ααWS/αα 組、ααCS/αα 組和ααQS/αα 組與女性對(duì)照組相比較，MCV、MCH 水平均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MCV：F=64.69，P＜0.05；MCH：F=80.05，P＜0.05）。男性αα/ααQS組與男性正常組比較HGB 顯著性降低（t=3.272，P＜0.05），男性αα/ααCS組與男性正常組比較Hb A2 顯著性降低（t=2.565，P＜0.05），女性ααCS/αα 組（Hb A2：t=17.279，P＜0.05）和ααQS/αα（HGB：t=6.295，P＜0.05）組具有同樣的趨勢(shì)。

2.3 --SEA/ααT及-α/ααT的血液學(xué)特征分析

--SEA/ααT及-α/ααT的血常規(guī)及血紅蛋白電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。各組的HGB、MCV、MCH 均有下降，--SEA/ααCS的HbA2 有顯著的下降，而MCV 出現(xiàn)增高的現(xiàn)象。--SEA/ααCS與--SEA/ααQS均出現(xiàn)血紅蛋白H 及血紅蛋白Bart’s，而--SEA/ααWS未發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)圖4。在--SEA/ααQS的兩例患者中，有一例為新生兒。

3 討論

非缺失型α-地貧的分子致病基礎(chǔ)是α 珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)序列發(fā)生單堿基置換或者存在核苷酸的缺失或插入所致，通常以αT 表示累及的基因。非缺失型a-地貧的基因型，目前已報(bào)道80 余種，常發(fā)生于α2 基因［4］，約占α-地貧的5%，αα/ααCS、αα/ααQS和αα/ααWS是我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)較為常見(jiàn)的突變類型［5］。

本文從27502 受檢者中，檢出307 例非缺失型α 地貧患者，非缺失型α-地貧的發(fā)生率為1.12%。目前的文獻(xiàn)報(bào)道有廣西南寧地區(qū)［6］、清遠(yuǎn)［7］及中山［8］、廈門［9］等地方的非缺失α 地貧流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，清遠(yuǎn)地區(qū)報(bào)道的以ααWS/αα 檢出率最高，中山地區(qū)以ααQS/αα 常見(jiàn)，而廣西南寧及廈門則以ααCS/αα 最為常見(jiàn)。本研究數(shù)據(jù)顯示最常見(jiàn)的非缺失型 α-地貧基因突變類型是 αα/ααWS（44.63%），其次是αα/ααCS（25.73%）和αα/ααQS（14.00%），與清遠(yuǎn)地區(qū)一致，但與廣西南寧、中山及廈門結(jié)果存在差異，經(jīng)過(guò)分析認(rèn)為主要由以下幾點(diǎn)原因?qū)е拢貉芯亢Y查的樣本量存在差異，樣本量少容易產(chǎn)生較大誤差；挑選的篩查對(duì)象差異會(huì)影響陽(yáng)性率，基因型頻率存在明顯地域差異，人群挑選的不同也導(dǎo)致結(jié)果不能直接進(jìn)行比較。本研究針對(duì)的是在本院進(jìn)行地貧篩查的所有人群，因此可補(bǔ)充本地區(qū)的非缺失α 地貧流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

從血液學(xué)指標(biāo)來(lái)看，αα/ααQS攜帶者的血液學(xué)表型相對(duì)較重些，該結(jié)果與以往報(bào)道的結(jié)果基本一致［10］。αα/ααCS是α2 基因終止密碼子的突變使mRNA 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)至3'非翻譯區(qū)，進(jìn)而影響mRNA的穩(wěn)定性，使其極容易被破壞；αα/ααQS是α2 基因密碼子125CTG 變?yōu)镃CG，導(dǎo)致翻譯后產(chǎn)生高度不穩(wěn)定的肽鏈，易被蛋白酶水解，以上突變均會(huì)讓?duì)?珠蛋白鏈合成量減少［2］。αα/ααWS突變也發(fā)生在α2 基因上，但其所導(dǎo)致的α-珠蛋白鏈合成減少的影響程度較低。以上分組的HGB、MCV、MCH 的結(jié)果差異說(shuō)明基因突變類型對(duì)α-珠蛋白鏈合成減少的程度有重要影響，影響程度低則指標(biāo)趨向正常的可能性大，提示我們今后要進(jìn)行地貧的全面基因篩查，血液學(xué)指標(biāo)的截值也需要針對(duì)各基因型進(jìn)行細(xì)化以提高初篩檢出率。

HbH 病分為缺失型HbH 病和非缺失型HbH病，非缺失型HbH 病比缺失型導(dǎo)致更嚴(yán)重的a 珠蛋白鏈合成的減少，因此臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重。Chanchai Traivaree 等［11］報(bào)道過(guò)，在泰國(guó)人群中，非缺失型HbH 病患者的血液學(xué)表現(xiàn)比缺失型HbH病患者的血液學(xué)表現(xiàn)嚴(yán)重。本文統(tǒng)計(jì)了3 種非缺失型HbH 病的類型，--SEA/ααQS的臨床表現(xiàn)相對(duì)較重。三種非缺失型HbH 病的臨床特征與《地貧預(yù)防控制操作指南》［10］一致。但目前本研究未發(fā)現(xiàn)ααCS/ααCS、ααCS/ααQS及ααQS/ααQS的純合子患者，部分特殊基因類型樣本量較少，未能全面涉及，不足以反應(yīng)該類人群血液學(xué)情況，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證分析，以豐富數(shù)據(jù)多態(tài)性。

總的來(lái)說(shuō)，在非缺失型α-地貧篩查中，我們應(yīng)密切留意受檢者的MCV 值和MCH 值及血紅蛋白電泳結(jié)果，以提示疑似攜帶者做進(jìn)一步基因檢測(cè)。