張樹山，張德福，戴建軍，吳彩鳳，孫玲偉

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106）

優(yōu)秀種公羊是影響育種效率的核心因素之一，而精液冷凍保存技術(shù)正是提高優(yōu)秀種公羊利用效率的重要途徑。羊冷凍精液的應(yīng)用不僅能通過減少公羊飼養(yǎng)數(shù)量來提高經(jīng)濟(jì)效益，也可大大降低或避免疫情發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，在綿羊的新品種培育和遺傳資源保護(hù)方面均具有重大意義[1]。綿羊精液冷凍保存技術(shù)始于20 世紀(jì)50 年代，最初冷凍精液（采用牛冷凍稀釋液）人工授精受胎率僅為5%，80 年代的平均受胎率才達(dá)到50%左右[2]。從20世紀(jì)90 年代至今，綿羊冷凍精液的輸精效果受冷凍技術(shù)水平、母羊發(fā)情鑒定及輸精方法等多個(gè)環(huán)節(jié)因素影響，常規(guī)方法輸精的受胎率不到60%，而采用腹腔鏡子宮角輸精能獲得與鮮精相當(dāng)?shù)乃絒1]。普遍認(rèn)為，綿羊精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用相對(duì)滯后，主要受制于以下因素：第一，落后的硬件水平使羊精液冷凍保存技術(shù)長(zhǎng)期處于低水平的平臺(tái)期；第二，綿羊子宮頸的特殊的螺旋形構(gòu)造，運(yùn)動(dòng)能力降低的冷凍精子通過子宮頸難度較大，導(dǎo)致綿羊冷凍精液授精受胎率遠(yuǎn)低于鮮精水平，且一直沒能建立與冷凍精液相配套的非手術(shù)法深部位輸精方法；第三，活體種公羊仍是國內(nèi)綿羊育種企業(yè)遺傳資源交流的主要形式，對(duì)綿羊冷凍精液需求不是很緊迫。此外，羊精液和體細(xì)胞等冷凍保存技術(shù)大多由相關(guān)科研單位攻關(guān)并掌握，而在過去幾十年里，國內(nèi)產(chǎn)、研資源整合程度較低，這也是制約國內(nèi)綿羊育種和集約化生產(chǎn)進(jìn)程的一個(gè)重要因素。

近十年來，家畜精液冷凍研究和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的硬件水平得到極大提高，如精子冷凍儀、降溫平衡及精液灌裝-封口等設(shè)備的廣泛應(yīng)用，使家畜冷凍精液實(shí)現(xiàn)商業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)，為綿羊精液冷凍保存技術(shù)的提高提供了較好條件。各級(jí)政府部門已通過項(xiàng)目和政策支持等手段促進(jìn)科研院所與畜牧企業(yè)聯(lián)合申報(bào)、主持科研項(xiàng)目及科研成果轉(zhuǎn)化，已取得顯著成效。此外，近幾年由于家畜活體運(yùn)輸導(dǎo)致疫情頻發(fā)，導(dǎo)致活體種羊遠(yuǎn)距離引種難度增大，冷凍精液可能是最合適的替代形式。本文對(duì)綿羊精液冷凍技術(shù)研究發(fā)展現(xiàn)狀做一綜述，建議加強(qiáng)綿羊生產(chǎn)企業(yè)和科研單位資源整合，以期提高綿羊精液冷凍保存技術(shù)水平并推動(dòng)冷凍精液的商業(yè)化生產(chǎn)。

1 綿羊精液冷凍保存技術(shù)的關(guān)鍵因素

1.1 冷凍稀釋液

1.1.1 冷凍稀釋基礎(chǔ)液（含有雞蛋卵黃但無甘油等冷凍保護(hù)劑）綿羊冷凍稀釋基礎(chǔ)液主要有以下幾類：①基于檸檬酸-果糖（或葡萄糖）、脫脂牛奶、乳糖、蔗糖、Tris 的稀釋液。綿羊精液的滲透壓約為382 mOsm，早期研究者們考慮到稀釋液加入甘油后會(huì)導(dǎo)致溶液滲透壓下降，其認(rèn)為高滲透壓的“檸檬酸-果糖（或葡萄糖）卵黃稀釋液”中的單糖可進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，從而降低滲透壓變化對(duì)精子產(chǎn)生的負(fù)面影響[3]。利用檸檬酸-果糖（或葡萄糖）類稀釋液制備羊冷凍精液的輸精受胎率為17%～40%[4]。②基于脫脂牛奶的稀釋液。早期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫脂牛奶（巴氏消毒處理）單獨(dú)使用或與檸檬酸、葡萄糖等組合使用，相互之間冷凍效果差異不大[6]。脫脂牛奶稀釋液在歐洲國家應(yīng)用較多，冷凍精液輸精的受胎率平均在30%～45%[4]。該類稀釋液的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、方便，盡管動(dòng)物源成分的牛奶存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，目前仍廣泛使用[5]。③基于乳糖的稀釋液。乳糖能在冷凍降溫過程中降低溶液結(jié)晶溫度，與EDTA-Na 組合的稀釋液的冷凍效果較好，該類稀釋液廣泛用在牛、豬和綿羊等家畜[7]精液冷凍。Platov 等[6]在綿羊上利用乳糖類冷凍稀釋液結(jié)合兩步稀釋法制作顆粒凍精，受胎率約為26%～60%。④基于蔗糖的稀釋液。早期研究就發(fā)現(xiàn)，蔗糖保護(hù)精子頂體完整性的功能優(yōu)于葡萄糖和果糖等雙糖[7]。故研究者們?cè)谡崽窍♂屢夯A(chǔ)上添加維生素E、二丁羥基甲苯（Butylated Hydroxytoluene，BHT）和海膽色素A（Echinochrome A）等抗氧化劑，開發(fā)出多個(gè)配方并使用至今，制作的綿羊顆粒凍精受胎率為19%～55%[8]。⑤基于Tris 的稀釋液。20 世紀(jì)70 年代Tris 就開始用于綿羊精液冷凍，綿羊精子對(duì)Tris 的耐受濃度為250～400 M。Tris 與葡萄糖組合的效果優(yōu)于乳糖和果糖等其他雙糖，制作的顆粒凍精輸精受胎率為30%～57%[9]。Tris-葡萄糖配方仍是目前常用的冷凍稀釋液[10]。目前冷凍稀釋液研發(fā)已不再局限于上述分類，研究人員以精子適宜的滲透壓和pH 范圍作為約束條件，采用糖類（單糖、雙糖及多糖）、抗氧化凋亡成分及一些兩性離子緩沖液等相互組合優(yōu)化，研發(fā)出與細(xì)管法冷凍和精子冷凍儀相配套的冷凍稀釋基礎(chǔ)液[11-12]。

自動(dòng)物精液冷凍保存技術(shù)研究以來，卵黃一直是保護(hù)精子免受冷休克打擊的主要成分，其機(jī)理可能是卵黃中的低密度脂蛋白、磷脂及膽固醇等成分能進(jìn)入精子質(zhì)膜和頂體外膜中，通過增強(qiáng)膜穩(wěn)定性來發(fā)揮保護(hù)作用[13-14]。近十幾年來，出于對(duì)畜牧業(yè)的生物安全性和商品化稀釋液生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化等因素考慮，研究者們一直努力利用非動(dòng)物源、類卵黃功能性成分替代卵黃，如已開發(fā)出多個(gè)大豆卵磷脂的冷凍稀釋液配方，且對(duì)精子的冷凍保護(hù)效果與卵黃相當(dāng)或接近。

1.1.2 冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑中尤其甘油在精子冷凍保存技術(shù)發(fā)展歷程上至關(guān)重要，其在精子冷凍上應(yīng)用使精子冷凍保存成為可能。作為滲透性冷凍保護(hù)劑，甘油有較強(qiáng)的親水性，可以在細(xì)胞脫水過程中，通過改變精子細(xì)胞外滲透壓來降低精子細(xì)胞內(nèi)含水量，從而減少細(xì)胞內(nèi)生成冰晶對(duì)精子的危害，且能限制和干擾水分子晶格的排列來抑制細(xì)胞內(nèi)外水形成冰晶，使水處于過冷狀態(tài)降低形成結(jié)晶的溫度[15-16]；甘油也容易滲透進(jìn)入綿羊精子細(xì)胞內(nèi)，使水分和一些鹽類排出胞外，避免電解質(zhì)濃度增加的不良影響[17]。目前在綿羊精子冷凍中，顆粒法冷凍甘油較適宜添加水平為3%～4%，而細(xì)管法冷凍為6%～9%[1]?？紤]到甘油和DMSO 等滲透性冷凍保護(hù)劑均有不同程度的毒性，研究者們采用兩步稀釋法，試圖通過降低甘油與精子的接觸時(shí)間和添加時(shí)溫度來降低對(duì)精子毒性作用，結(jié)果表明與一步稀釋法差異不顯著且操作繁瑣，故目前廣泛使用一步稀釋法，即在精液采集后（約30℃）就加入含有甘油（終濃度6%～8%）的稀釋液，經(jīng)1～3 h 降溫平衡至5℃、冷凍[11,18]。

冷凍保護(hù)劑的發(fā)展趨勢(shì)是利用無毒、高效的冷凍保護(hù)成分部分或完全取代甘油。研究證實(shí)，一些雙糖和植物性多糖類[5]作為非滲透性冷凍保護(hù)劑對(duì)精子有較好的保護(hù)作用，但仍不能完全代替甘油為代表的滲透性冷凍保護(hù)劑，目前仍是通過甘油與非滲透性冷凍保護(hù)劑結(jié)合使用來提高精子冷凍保護(hù)效果。

1.1.3 冷凍稀釋液的抗菌成分 動(dòng)物精液及使用的稀釋液中均含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、適宜的pH 和滲透壓，在沒有抗生素或抗生素失活情況下，細(xì)菌數(shù)量會(huì)以幾何級(jí)快速增加。含有微生物或病原體污染的液態(tài)（4～20℃）和冷凍保存精液（-196℃）可能引起母畜繁殖障礙或疾病[19]。目前，抑制家畜精液中微生物和細(xì)菌的主要手段仍是添加青、鏈霉素等常規(guī)及一些新型廣譜抗生素。然而，抗生素會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)精子有不可忽視的毒性作用。如在澳大利亞和德國約90%的豬AI 中心仍使用單一抗生素，其中保存精液檢測(cè)出慶大霉素耐藥菌的AI 中心比例分別為66.7%（18/24）和26%（88/344）[20]。出于耐藥性和抑菌效果考慮，人們開始將一些新型廣譜抗生素低濃度結(jié)合使用（即“雞尾酒”法）用于降低精液保存過程中的抗生素耐藥性[21]。此外，抗菌肽具有微量抗菌譜廣（包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌和寄生蟲）、抗部分帶包膜病毒的作用，且大多數(shù)抗菌肽對(duì)正常真核細(xì)胞無毒性或低毒性、幾乎無耐藥性，被認(rèn)為是現(xiàn)有抗生素的最佳替代品。迄今為止，已有一些人工合成抗菌肽在家畜精液保存中的研究[22-23]。然而，目前從已知海量的抗菌肽中篩選、試驗(yàn)工作量巨大，以及天然提取、化學(xué)合成和基因工程等方法仍存在局限性，故為精液冷凍保存尋找有效的抗菌肽來替代抗生素仍任重道遠(yuǎn)。

1.2 綿羊精子冷凍及解凍方法 在精子程序冷凍儀廣泛應(yīng)用前，綿羊精子冷凍普遍采用顆粒法或PVC 細(xì)管法，冷凍過程中的降溫速率主要通過控制銅網(wǎng)或冷凍架與干冰或液氮面的距離實(shí)現(xiàn)。顆粒法凍精制作簡(jiǎn)單、成本低，但不易標(biāo)記、易污染，且解凍不方便。而PVC 細(xì)管法不存在上述問題，且宜貯存、適合自動(dòng)化的商業(yè)化凍精生產(chǎn)。近十年來，家畜精液冷凍的硬件水平得到了極大提高。通過調(diào)控降溫速率的低溫操作柜結(jié)合水浴方法，能使精液冷凍前降溫平衡比傳統(tǒng)的在冰箱內(nèi)包裹降溫更為平穩(wěn)；精液細(xì)管自動(dòng)灌裝、封口和打印設(shè)備的廣泛應(yīng)用可大大節(jié)約勞動(dòng)力且實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化；采用精子冷凍專用的程序化冷凍儀可以通過計(jì)算機(jī)控制液氮噴速精確控制精液降溫速率，使精液冷凍降溫程序?qū)崿F(xiàn)最優(yōu)化成為可能。綜上，綿羊冷凍精液的商業(yè)化生產(chǎn)的硬件條件已具備。

冷凍精液的解凍要經(jīng)過-15～ -60℃的危險(xiǎn)溫區(qū)，故精液的升溫過程與冷凍過程對(duì)冷凍精子的品質(zhì)同樣重要。普遍認(rèn)為，小劑型凍精采用高溫快速解凍法效果好，而大劑型凍精則不適合快速解凍。Graham 等[24]研究證實(shí)，65℃快速解凍精液的產(chǎn)羔率顯著高于40℃解凍。筆者所在課題組在湖羊上證實(shí)，冷凍精液細(xì)管（0.25 mL）在70℃條件下的解凍效果優(yōu)于其他溫度（待發(fā)表）。研究已證實(shí)，綿羊冷凍精液濕解凍法優(yōu)于干解凍法[2]。解凍液中的抗氧化等成分可抑制解凍后精子活性氧（ROS）對(duì)精子的損傷，通過稀釋降低滲透性冷凍保護(hù)劑的濃度可降低對(duì)精子的毒性作用，且能在保證有效精子數(shù)量前提下增加輸精母羊的數(shù)量[25]。

1.3 人工授精及同期發(fā)情 由于綿羊子宮頸的生理結(jié)構(gòu)特性，使得母羊因素-人工輸精環(huán)節(jié)與精子冷凍效果一樣重要。

綿羊?qū)儆诩竟?jié)性多次發(fā)情家畜，具有發(fā)情期短、發(fā)情癥狀不明顯等特征，發(fā)情鑒定一般采用公羊試情，其準(zhǔn)確性主要取決于輸精員的經(jīng)驗(yàn)。最近幾年，研究發(fā)現(xiàn)綿羊的卵泡直徑超過5 mm 以上時(shí)，利用B 超很容易鑒別并形成良好聲像圖，可以根據(jù)綿羊卵泡發(fā)育情況來預(yù)測(cè)排卵時(shí)間，能為操作人員提供輸精較適宜時(shí)機(jī)[26]。但利用B 超進(jìn)行發(fā)情鑒定存在設(shè)備成本高、對(duì)操作人員要求高等問題，在羊場(chǎng)普遍應(yīng)用存在一定難度。

綿羊輸精方法主要有陰道輸精法（Vaginal artificial insemination，VAI）、子宮頸輸精法（Cervical Artificial Insemination，CAI）、經(jīng)子宮頸輸精法（Post-cervical Insemination，PCAI）和腹腔鏡輸精法（Laparoscopic Artificial Insemination，LAI）4 種，技術(shù)要點(diǎn)及效果見表1。

Eppleston 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，輸精深度每增加1 cm，受胎率增加7%～12%，即輸精部位越接近受精部位，輸精效果越好。一些研究者通過改進(jìn)常規(guī)輸精器或輸精前注射松弛子宮頸激素等手段增加綿羊輸精深度，但冷凍精液的受胎率提高幅度不大[28]。早期冷凍精液輸精試驗(yàn)多采用傳統(tǒng)子宮頸輸精法，該輸精方法操作雖然便捷，但輸精量大、情期需多次輸精（2～3 次）和受胎率較低。目前在綿羊上常規(guī)手術(shù)法或腹腔深部位（子宮角）輸精是適合冷凍精液輸精的有效方法。手術(shù)法和腹腔鏡可以清晰觀察到綿羊卵泡和排卵點(diǎn)，是目前最直觀、最準(zhǔn)確的發(fā)情鑒定方法，能將少量冷凍精液越過子宮頸送至離受精部位更近的一側(cè)或雙側(cè)子宮角，理論上能達(dá)到近100%的受胎率。其中，腹腔鏡深部位輸精法雖然對(duì)設(shè)備和操作有較高要求，但與手術(shù)法相比具有微創(chuàng)、出血少和術(shù)后母羊恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)。早在20 世紀(jì)80 年代，腹腔鏡輸精法在澳大利亞等養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)國家就已廣泛用于綿羊冷凍精液的輸精。國內(nèi)，腹腔鏡技術(shù)最早應(yīng)用于綿羊胚胎移植中，直到90 年代才開始有用于深部位輸精的報(bào)道。張堅(jiān)中等[29]、石國慶等[30]和王軍建等[31]先后利用腹腔鏡技術(shù)進(jìn)行綿羊冷凍精液輸精試驗(yàn)，情期受胎率在65.2%～75.8%。目前，國內(nèi)一些專業(yè)化公司已建立了同期發(fā)情-腹腔鏡輸精技術(shù)體系并實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，能為國內(nèi)綿羊冷凍精液的應(yīng)用提供較完善的服務(wù)。

表1 綿羊的常用輸精技術(shù)[25]

一般認(rèn)為，在綿羊發(fā)情的適宜時(shí)間范圍內(nèi)輸入的有效精子數(shù)比輸精次數(shù)更為重要，但適宜的輸精時(shí)機(jī)較難把握，故綿羊鮮精或冷凍精液的常規(guī)方法輸精，通常采用多次輸精來提高受胎率。以冷凍精液為例，一般在發(fā)情早期進(jìn)行第1 次輸精，間隔8～24 h 再進(jìn)行第2 次輸精，受胎率可提高12.5%～25.9%[25-26]；也有報(bào)道在情期內(nèi)進(jìn)行3 次輸精，但能否提高受胎率存在爭(zhēng)議。可見，采用常規(guī)輸精法對(duì)冷凍精液的輸精量有較高要求，而手術(shù)或腹腔鏡輸精法可以大大減少輸精量，且只需要輸精1 次即可。

同期發(fā)情技術(shù)能通過激素控制并調(diào)整綿羊群體的發(fā)情周期，使它們?cè)谔囟ǖ臅r(shí)間內(nèi)集中表現(xiàn)發(fā)情，已在集約化、規(guī)?；木d羊育種和生產(chǎn)企業(yè)中廣泛應(yīng)用，尤其與腹腔鏡輸精法結(jié)合并發(fā)展成為一個(gè)較成熟的技術(shù)體系，能大大提高鮮精或冷凍精液的受胎率[32]。目前，在綿羊上還沒有較成熟、高效的非手術(shù)法深部位輸精方法，在今后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)綿羊冷凍精液最有效、可行的輸精方法仍然是結(jié)合同期發(fā)情的腹腔鏡輸精法。

2 通過產(chǎn)研結(jié)合促進(jìn)綿羊精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用

2.1 國內(nèi)科研單位與綿羊育種企業(yè)建立優(yōu)秀種公羊“精子庫”的迫切性和必要性 我國地方綿羊品種在世界綿羊遺傳資源中具有重要的地位，但目前地方綿羊品種原有的優(yōu)良特性逐漸退化，部分品種甚至已瀕臨絕種或絕種。其原因包括幾個(gè)方面：第一，國內(nèi)綿羊育種長(zhǎng)期受肉用性能為主的市場(chǎng)導(dǎo)向影響，大量引入、飼養(yǎng)外來肉用品種對(duì)地方品種進(jìn)行雜交改良，造成我國固有綿羊品種遺傳多樣性和純種數(shù)量受到破壞和下降；第二，人們對(duì)地方品種的保護(hù)意識(shí)不足，用于地方綿羊品種保存的經(jīng)費(fèi)極為有限，而傳統(tǒng)的活體保種需要建立專門化的保種場(chǎng)，基礎(chǔ)建設(shè)成本較高；第三，我國部分綿羊育種、生產(chǎn)企業(yè)及保種場(chǎng)大多科技力量較弱，且與相關(guān)科研院所銜接不夠緊密，在利用新技術(shù)進(jìn)行遺傳資源保存方面也存在較大困難。近三十年來，由于國外肉用和肉毛兼用的綿羊育種水平的比較優(yōu)勢(shì)，促使國內(nèi)大型綿羊育種和生產(chǎn)單位耗費(fèi)巨資從歐美養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)國家大規(guī)模、持續(xù)引進(jìn)優(yōu)秀種羊，如德國肉用美利奴、特克塞爾、無角道賽特、波德代羊、夏洛萊、薩?？撕投挪囱虻缺姸嗳庥闷贩N，為改良我國已有肉羊品種發(fā)揮了積極的作用。故國內(nèi)引進(jìn)的大量?jī)?yōu)秀種羊以及自主培育品種/品系也是不可忽視的一個(gè)遺傳資源寶庫。

家畜遺傳資源保存除活體保存外，主要有精子、卵母細(xì)胞、胚胎及體細(xì)胞冷凍保存等形式。其中，精液冷凍保存技術(shù)是公認(rèn)的性價(jià)比最高的遺傳資源保存方法。一方面，公畜的遺傳影響、選擇強(qiáng)度、選擇準(zhǔn)確性和年更新率等均遠(yuǎn)大于母畜，且跨場(chǎng)比較條件下群體變異度擴(kuò)大，使得保存優(yōu)秀種公畜的遺傳資源更為有意義；另一方面，“精液冷凍保存-人工授精”的技術(shù)難度和成本均遠(yuǎn)低于“卵母細(xì)胞/胚胎冷凍-體外受精/移植”及“體細(xì)胞冷凍保存-克隆”等技術(shù)體系。以冷凍精液的形式來保存動(dòng)物遺傳資源始于20 世紀(jì)70 年代。在英國和德國等發(fā)達(dá)國家，早在七八十年代就已建立了牛、綿羊等冷凍“精子庫”；前蘇聯(lián)也分別冷凍保存了26個(gè)品種牛和33 個(gè)品種羊的數(shù)十萬份精液[33]。國內(nèi)的家畜冷凍“精子庫”建設(shè)相對(duì)滯后，保種仍以傳統(tǒng)的活體保種為主。如“九五計(jì)劃”中，我國建立了魯西黃牛的精子和胚胎庫，標(biāo)志著精子冷凍保存技術(shù)開始用于我國家畜遺傳資源保護(hù)[34]。然而，國內(nèi)早期的家畜“精子庫”建設(shè)是基于泡沫盒熏蒸、顆粒法冷凍等傳統(tǒng)方法，冷凍精子品質(zhì)和效率都較低；而當(dāng)前家畜精液冷凍技術(shù)平臺(tái)已今非昔比，部分畜牧科研單位和育種企業(yè)已擁有精子冷凍儀、精液的灌裝-封口-標(biāo)記等先進(jìn)設(shè)備，為提高綿羊“精子庫”的建設(shè)水平和效率達(dá)到新高度提供了有力保障。地方綿羊品種種質(zhì)資源保護(hù)中，可以由科研單位或育種型企業(yè)發(fā)揮技術(shù)和設(shè)備優(yōu)勢(shì)，為傳統(tǒng)保種場(chǎng)提供精子冷凍保存技術(shù)服務(wù)和“精子庫”的維護(hù)；而企業(yè)的種質(zhì)資源保存則通過與科研單位及專門化技術(shù)公司等社會(huì)資源的高效整合，能有效避免重復(fù)建設(shè)并實(shí)現(xiàn)社會(huì)資源的高效整合。

基于綿羊精子耐凍性存在明顯的個(gè)體差異問題，先對(duì)種公羊群體進(jìn)行精子耐凍性篩選，將耐凍性較好的種公羊精子入庫長(zhǎng)期保存，而對(duì)精子耐凍性較差公羊則通過體細(xì)胞的采集、培養(yǎng)后作冷凍保存，在需要時(shí)再用克隆技術(shù)將其“復(fù)活”。

2.2 國內(nèi)綿羊育種企業(yè)以冷凍精液取代活體種公羊輸出的必要性 種公羊的活體引種一直是過去和目前國內(nèi)外引種的主要方式，高昂的引種成本（包括購買和運(yùn)輸費(fèi)用）及種公羊飼養(yǎng)及管理成本是造成養(yǎng)羊業(yè)利潤(rùn)微薄的一個(gè)重要因素。此外，對(duì)引種單位及所在地域而言，引入遺傳資源意味著面對(duì)潛在的生物安全危機(jī)。近幾年，政府已加強(qiáng)了對(duì)家畜活體引種的規(guī)范和限制，先后出臺(tái)了限制畜禽調(diào)運(yùn)、加強(qiáng)畜禽移動(dòng)監(jiān)管等措施（《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2 號(hào)》，2018 年）。2013—2016 年，國內(nèi)多地區(qū)頻繁發(fā)生嚴(yán)重的小反芻獸疫疫情，2018 年非洲豬瘟疫情爆發(fā)，一次又一次地為全社會(huì)敲響了生物安全警鐘。家畜活體長(zhǎng)途運(yùn)輸門檻提高會(huì)大大增加家畜引種的難度和成本，預(yù)示著家畜活體引種被嚴(yán)格限制和取代已是大勢(shì)所趨。普遍認(rèn)為，低溫（5℃）和冷凍保存精液是目前能取代種公羊活體引種的可行方式?，F(xiàn)有技術(shù)條件下，豬液態(tài)保存精液在適宜溫度（5℃）下的有效保存期普遍在2～6 d，輻射地域則取決于運(yùn)輸條件。但其使用受時(shí)空限制明顯，僅適合近距離、短期內(nèi)使用。

近幾年來，在各級(jí)政府的宏觀調(diào)控和業(yè)內(nèi)人士的不懈努力下，國內(nèi)家畜精液冷凍保存的硬件水平得到質(zhì)的提升。繼牛之后豬冷凍精液也開始步入商業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程，廣東溫氏集團(tuán)、上海祥欣畜禽有限公司等國內(nèi)育種企業(yè)與科研院所或家畜精液冷凍專門化技術(shù)公司合作，并相繼建立冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)平臺(tái)，已開始為國內(nèi)外客戶提供優(yōu)質(zhì)遺傳資源和配套技術(shù)指導(dǎo)。上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所與上海永輝羊業(yè)有限公司等單位聯(lián)合申報(bào)市科委“羊的精液冷凍保存技術(shù)研究”，便是產(chǎn)、研結(jié)合較好的范例。與牛和豬冷凍精液相比，綿羊冷凍精液實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)、銷售還有一定差距。另外，建立綿羊冷凍精液相配套的深部位輸精法，或使客戶接受微創(chuàng)的腹腔鏡輸精方法，也是綿羊冷凍精液廣泛應(yīng)用的重要前提[35]。

養(yǎng)羊業(yè)完全可以參照豬冷凍精液的成功模式，綿羊育種企業(yè)與科研單位通過資源整合、共建冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)平臺(tái)（或成立專門化公司），生產(chǎn)平臺(tái)可建立在規(guī)?；d羊育種企業(yè)中，或建立以小型儀器為主、可面向全國客戶提供綿羊精液冷凍技術(shù)服務(wù)的流動(dòng)平臺(tái)；同時(shí)，在原活體種羊銷售網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上建設(shè)綿羊冷凍精液銷售、技術(shù)指導(dǎo)等體系，并加強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)銷售、種羊遺傳信息和售后服務(wù)等建設(shè)。

可以預(yù)見，以冷凍精液形式取代種公羊活體引種，不僅為引種公司安全生產(chǎn)提供有力保障，也能大幅度降低種公羊運(yùn)輸、飼養(yǎng)、管理及免疫等成本，從而提高綿羊育種和生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

3 小 結(jié)

普遍認(rèn)為，綿羊冷凍精液的廣泛應(yīng)用將為其育種和生產(chǎn)模式等帶來極大變化，是養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展史上的一次技術(shù)革命。綜上，推動(dòng)國內(nèi)大型綿羊育種企業(yè)獨(dú)立或與相關(guān)科研單位及專門技術(shù)服務(wù)公司聯(lián)合起來，推動(dòng)綿羊精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展并實(shí)現(xiàn)冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)，并同步實(shí)現(xiàn)我國地方品種和引進(jìn)品種的優(yōu)秀種公羊遺傳資源有效保存，可加速國內(nèi)綿羊聯(lián)合育種進(jìn)展，從而推動(dòng)我國養(yǎng)羊業(yè)實(shí)現(xiàn)育種跨越式、可持續(xù)發(fā)展。