張琦悅，何 春，孫浩瑋，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

白色脂肪組織（WAT）是動物機(jī)體中良好的儲能與供能物質(zhì)，還可以作為分泌器官合成多種脂肪因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理、病理狀態(tài)[1]。對于家畜而言，適量的脂肪組織不僅可以保證家畜機(jī)體健康，還可改善肉的風(fēng)味[2]。闡明調(diào)控脂肪形成過程中的分子機(jī)制對于畜牧業(yè)及肉類生產(chǎn)行業(yè)都至關(guān)重要。miRNA 作為一個重要的調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)控靶mRNA 的翻譯與穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)或抑制成脂相關(guān)基因的表達(dá)，在脂肪形成過程中發(fā)揮重要作用。在家畜肉品質(zhì)改良方面，目前有大量研究集中于從營養(yǎng)角度調(diào)控脂質(zhì)的合成與代謝過程，而在遺傳發(fā)育方面的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究相對較少。本文總結(jié)miRNA 的生物學(xué)特性及作用機(jī)制，綜合分析近年來與脂肪組織相關(guān)的miRNA 的重要研究，并對其未來的發(fā)展進(jìn)行展望。

1 miRNA 概述

miRNA 的發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷了數(shù)十年的時間。最早探索到的miRNA 是Lee 等[3]于1993 年在線蟲研究中克隆出來的，具有調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育的功能。但這項研究并未引起科學(xué)界的重視，直到2000 年Ruvkun[4]在線蟲研究中又發(fā)現(xiàn)一個相似的miRNA——let-7，這2 個非編碼基因都可以通過與基因3'-UTR 結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。自此人們意識到這種小RNA 可能是機(jī)體中廣泛存在的一種調(diào)節(jié)因子。2001 年此類小RNA 被正式命名為microRNA，簡稱為miRNA[5]。隨后多種miRNA 在不同物種中被發(fā)現(xiàn)，并證實可以調(diào)控各種重要的生理活動，同時對于miRNA 的生物學(xué)本質(zhì)與作用機(jī)制的研究也逐漸明朗。

1.1 miRNA 的來源 機(jī)體內(nèi)絕大多數(shù)miRNA 為內(nèi)源性RNA，其中編碼基因位于內(nèi)含子區(qū)并與宿主基因共同受到上游啟動子調(diào)控的稱為內(nèi)含子miRNA；位于基因間隔區(qū)并可以獨立轉(zhuǎn)錄的稱為基因間miRNA[6]。機(jī)體中還可能存在一定水平的外源性miRNA[7-8]。Zhang等[8]在各種動物的血液和組織中均檢測到了植物源性miRNA，并鑒定出其中的MIR168a 能夠通過靶向低密度脂蛋白受體配體蛋白1（LDL Receptor Ligand Protein 1，LDLRAP1）影響肝臟正常功能，不過目前該項研究仍存在一定爭議。

1.2 miRNA 的合成 miRNA 的經(jīng)典合成過程如圖1 所示，首先miRNA 的基因組DNA 借助RNA 聚合酶Ⅱ（少數(shù)借助于RNA 聚合酶Ⅲ）轉(zhuǎn)錄為長達(dá)幾千nt 的primiRNA[9]。隨后在2 次核酸內(nèi)切酶的切割作用下最終形成成熟的miRNA[10]：第一次切割發(fā)生在細(xì)胞核中，是由Drosha 酶將pri-miRNA 從初始轉(zhuǎn)錄本上切割下來形成pre-miRNA。pre-miRNA 通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)運蛋白EXP5介導(dǎo)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer 酶二次切割為長度約22 nt 的雙鏈RNA[10]。Drosha 酶與Dicer 酶的切割具有相同的特點，即在切口處形成2 nt 的懸垂（Overhang）結(jié)構(gòu)，利于其裝載到沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（RNAInduced Silencing Complex，RSIC）上，RSIC 中的雙鏈RNA 要經(jīng)歷最后一步的選擇機(jī)制，雙鏈中5'端相對不穩(wěn)定的一條鏈傾向于被保留（稱作向?qū)ф湥硪粭l鏈則會被迅速降解（稱作隨從鏈）[11]。

1.3 miRNA 的作用機(jī)制 miRNA 需要被裝配到RSCI中才能行使其調(diào)控基因表達(dá)的功能。被結(jié)合的靶mRNA一般有3 種命運：①翻譯抑制。RISC 通過2 方面發(fā)揮抑制作用，一方面在翻譯起始之前抑制核糖體形成，從而阻止翻譯起始[12]；另一方面在翻譯過程中阻止核糖體前進(jìn)，導(dǎo)致翻譯終止[13]。②靶mRNA 的降解。RSCI可以抑制靶基因的正常轉(zhuǎn)錄，使靶mRNA 脫帽、脫尾最終降解[14]。③靶mRNA 的切割。RSIC 中的Ago2 可發(fā)揮切割作用[15]。其中要實現(xiàn)靶mRNA 切割需滿足2個條件：miRNA 被Ago2 蛋白緊密包裹且與靶mRNA完美匹配。miRNA 通過自身種子序列與靶mRNA 不同程度地結(jié)合，維持機(jī)體中蛋白質(zhì)的最佳水平。

2 影響脂肪細(xì)胞分化的miRNAs

脂肪細(xì)胞是動態(tài)且高度受調(diào)控的細(xì)胞群，脂肪生成是一個多步驟的過程，涉及多種信號通路如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、MAPK、TGFβ/smad 和一些核心轉(zhuǎn)錄因子如過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptors，PPARs）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/Enhancer-Binding Proteins，C/EBPs）、固醇調(diào)節(jié)元素結(jié)合蛋白1（Sterol-Regulatory Element Binding Proteins，SREBP1）等的重要調(diào)控作用。miRNA 可通過結(jié)合相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵組成元件，或者直接與核心轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控成脂標(biāo)志物，如脂肪酸結(jié)合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4，F(xiàn)ABP4）、葡萄糖轉(zhuǎn)運子4（Glucose Transporter 4，GLUT4）、脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)ASN）的表達(dá)，最終影響脂肪細(xì)胞分化。

2.1 miRNA 調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程中的經(jīng)典信號通路PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)脂質(zhì)生物合成并抑制脂解。一些研究表明，miRNA 在PI3K/Akt 信號通路調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。Akt 是PI3K/Akt 信號通路中c-Met 的下游效應(yīng)因子，在整個3T3-L1 細(xì)胞分化過程中，miRNA-206 可通過抑制靶基因c-Met 的表達(dá)，使Akt 磷酸化程度降低，從而抑制脂肪細(xì)胞分化[16]。Mi 等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p 可通過直接靶向IRS1/PI3K/Akt 胰島素信號通路的關(guān)鍵成員IRS1，在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。伊璨等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-143 可以與多聚營養(yǎng)素（Pleiotrophin，PTN）的3'-UTR結(jié)合，在通過PTN/PI3K/AKT 信號途徑的脂肪生成過程中起到抑制作用，從而促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。

MAPK 信號通路是由3 個順序活化的激酶組成的磷酸化系統(tǒng)的一部分并受磷酸化調(diào)節(jié)。在脂肪細(xì)胞分化中，有絲分裂克隆擴(kuò)增階段需要MAPK 信號通路的激活，但在終末分化階段中，MAPKs 通過磷酸化PPARγ抑制脂肪細(xì)胞分化[19]。Jin 等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-24 在3T3-L1 前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化過程中顯著上調(diào)，用miR-24-mimics 轉(zhuǎn)染3T3-L1 細(xì)胞之后，通過油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，miR-24 過表達(dá)組較對照組形成更多的脂滴，此外甘油三酯含量也增加了21.6%，說明miR-24 可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，進(jìn)一步的實驗證明MAPK7是miR-24 的直接靶點，miR-24 通過下調(diào)MAPK7 表達(dá)而發(fā)揮其成脂作用。Xie 等[21]實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-21a-5p 可減輕雙酚A（Bisphenol A，BPA）誘導(dǎo)的體內(nèi)肥胖，螢光素酶活性測定表明miR-21a-5p 通過靶向Map2K3 抑制BPA 誘導(dǎo)的3T3-L1 成脂分化。

2.2 miRNA 調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ是一種配體激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PPARγ在脂肪細(xì)胞分化早期表達(dá)并維持脂肪細(xì)胞的終末分化，同時激活脂肪細(xì)胞特異基因表達(dá)，產(chǎn)生脂肪細(xì)胞表型[22]。miR-130 可以同時靶向PPARγmRNA 的編碼區(qū)和3'-UTR 來有效抑制PPARγ表達(dá)，進(jìn)而減少脂肪形成[23]。在地塞米松誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積中，miR-130b 可以直接識別結(jié)合PPAR-γ的3'-UTR 并抑制PPARγ的表達(dá)，來減輕地塞米松誘導(dǎo)的豬前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積量的增加[24]。

C/EBPs 轉(zhuǎn)錄因子家族在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。C/EBPβ和C/EBPδ 是前脂肪細(xì)胞暴露于分化培養(yǎng)基后誘導(dǎo)的第一個轉(zhuǎn)錄因子，隨后誘導(dǎo)C/EBPα表達(dá)，C/EBPα充當(dāng)多種脂肪細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[25]。Feng 等[26]通過qPCR發(fā)現(xiàn)miR-326 在脂肪干細(xì)胞（Adipose-Derived Stem Cells，ASC）成脂分化過程中表達(dá)量降低，用慢病毒包裹miR-326 轉(zhuǎn)染hASCs 后，發(fā)現(xiàn)該處理組較對照組僅有少量脂滴合成，同時C/EBPα蛋白表達(dá)下降。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)C/EBPα的3'-UTR 具有2 個miR-326 的結(jié)合位點，進(jìn)一步實驗證實miR-326 通過與C/EBPα結(jié)合，降低其表達(dá)水平，從而導(dǎo)致hASCs 的成脂分化減少。

3 與脂質(zhì)代謝相關(guān)的miRNAs

脂質(zhì)代謝包括甘油三酯、膽固醇、磷脂、糖脂的合成與分解，以及脂蛋白代謝等。實驗證明，許多miRNA 已成為脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，通過靶向脂代謝中的關(guān)鍵酶如乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase，ACAC）以及重要的轉(zhuǎn)錄因子如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Proteins，SREBPs）和運輸脂類的脂蛋白等發(fā)揮其調(diào)控作用[27-28]。2003 年，在果蠅中首次描述了miRNA 在脂質(zhì)代謝中的作用，發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)三酰和二酰甘油含量隨miR-14 拷貝數(shù)的增加而減少[29]。隨后Varghese[30]在果蠅中發(fā)現(xiàn)miR-14 可直接靶向大腦中產(chǎn)生胰島素的分泌細(xì)胞中的Sugarbabe。Sugarbabe 編碼鋅指蛋白，該蛋白可調(diào)節(jié)神經(jīng)分泌細(xì)胞中的胰島素基因表達(dá)，以控制新陳代謝。

SREBPs 是一類膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，通過控制脂肪酸、磷脂、膽固醇的從頭合成以及膽固醇的攝取，在脂質(zhì)代謝中占據(jù)重要地位。SREBP 由SREBP-1a、SREBP-1c 和SREBP-2 3 個成員組成，其中SREBP-2 主要控制膽固醇的合成和攝取，而SREBP-1c 調(diào)節(jié)脂肪酸的合成。SREBP-1a 兼具以上3 種功能[31-32]。Yang 等[33]發(fā)現(xiàn)在HepG2 細(xì)胞中過表達(dá)miR-185 可抑制SREBP-2基因的表達(dá)并降低其蛋白質(zhì)水平，同時導(dǎo)致LDL 攝取和HMG-CoA 還原酶活性降低。Geng 等[34]首次證明了miR-98 通過直接靶向SREBP-2 使細(xì)胞內(nèi)總膽固醇水平降低，闡明miR-98 在膽固醇代謝中的新作用。

另外miR-122[35]、miR-370[36]、miR-758[37]、miR-27[38]、miR-30c[39]、miR223[40]、miR-144[41]、miR168a[8]、miR-302a[42]、miR378[43]等對脂質(zhì)代謝過程同樣起到調(diào)控作用。

4 脂肪組織來源的循環(huán)miRNAs

動物體成熟的miRNA 在細(xì)胞內(nèi)部形成并發(fā)揮功能，同時還可被釋放到動物的循環(huán)系統(tǒng)和各種體液中[44]。miRNA 可以包裝在一類被稱為細(xì)胞外囊泡的結(jié)構(gòu)中，這些囊泡包括外泌體和微囊泡，是細(xì)胞衍生的膜狀結(jié)構(gòu)，其中包含許多miRNA，既具有旁分泌的作用，又可以作為內(nèi)分泌因子，在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，從而建立細(xì)胞間通訊以及在遠(yuǎn)處的器官之間傳播以促進(jìn)器官間的物質(zhì)和信息交流[45-46]。

脂肪組織是循環(huán)miRNA 的主要來源，脂肪來源的循環(huán)miRNA 可以認(rèn)作為一類新型的脂肪因子。Thomas等[47]研究發(fā)現(xiàn)，在miRNA 加工酶Dicer 脂肪特異性敲除（ADicerKO）的小鼠以及患有脂肪營養(yǎng)不良的人類中，其循環(huán)性外泌體miRNA 都有很大程度減少，而接受白色特別是棕色脂肪組織（BAT）移植的ADicerKO 小鼠，體液中循環(huán)miRNA 含量可以達(dá)到野生型水平，同時還提高了其葡萄糖耐受性，這是首次研究報道脂肪來源的miRNA 是機(jī)體中所有循環(huán)miRNA 的重要來源。

脂肪組織中的主要細(xì)胞群是脂肪細(xì)胞，其他的常駐細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。脂肪組織中巨噬細(xì)胞相對于其他細(xì)胞類型的比例可以從瘦肉型個體的5%上升到肥胖型個體的50%[48]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織巨噬細(xì)胞（Adipose Tissue Macrophages，ATM）可以將含有miRNA 的外泌體（Exosomes，Exos）分泌到循環(huán)系統(tǒng)中，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體對胰島素的敏感性[49]。來自肥胖動物的ATM 分泌的Exos，其中所包含的miRNA 可以在體內(nèi)和體外被胰島素靶細(xì)胞吸收，從而導(dǎo)致細(xì)胞和全身性的胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良，而在體內(nèi)和體外使用瘦小鼠衍生的ATM-Exos 對肥胖個體進(jìn)行治療，相關(guān)癥狀可得到明顯改善[49-50]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 是二者ATM-Exos 中差異表達(dá)的miRNA之一，可以通過直接抑制其靶基因PPARγ來影響肥胖個體中胰島素信號的傳導(dǎo)并降低其葡萄糖耐受量[50]。

大量研究證實，肥胖機(jī)體中分泌的miRNA 譜會發(fā)生改變，從而影響循環(huán)miRNA 的分泌，并可能導(dǎo)致其他代謝器官的病理變化[51-52]。因此肥胖相關(guān)和/或脂肪組織衍生的循環(huán)miRNA 有成為新型生物標(biāo)志物的潛力，成為用于治療肥胖和相關(guān)疾病的新靶標(biāo)[53]。由此發(fā)展出的新型療法，如miRNA 模擬物、抗miRNA 寡核苷酸和裝載miRNA 的外泌體，可能使基于miRNA的療法在肥胖和代謝性疾病中的臨床應(yīng)用成為可能[48]。但循環(huán)miRNA 也存在一定缺陷。在動物模型中，可能是多個循環(huán)miRNA 以協(xié)調(diào)工作的方式來控制新陳代謝，而單個特異性循環(huán)miRNA 往往對代謝的影響較弱，另外，由于存在大量的未知靶點，循環(huán)miRNA 的靶向特異性較差，這可能導(dǎo)致基于miRNA 的治療出現(xiàn)脫靶不良反應(yīng)[54]。但這種以新形式存在并發(fā)揮作用的miRNA，依然為脂肪相關(guān)研究提供了新思路。

5 總結(jié)及展望

近年來，關(guān)于脂肪組織中miRNA 的功能研究日趨增多，均旨在闡明miRNA-靶基因-功能三者之間的關(guān)系。由于miRNA 與其靶基因并非軸線式的調(diào)控關(guān)系，而呈現(xiàn)出一個極具復(fù)雜性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，脂肪組織來源的循環(huán)miRNA 的發(fā)現(xiàn)，也為miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)增添了新的元素。隨著高通量測序技術(shù)和芯片技術(shù)水平不斷提高，越來越多的miRNA 被鑒定出具有重要的生物學(xué)功能，相關(guān)miRNA 靶基因預(yù)測軟件的研發(fā)也大大提高了對miRNA 靶點預(yù)測的準(zhǔn)確性，然而其中僅有一小部分被證實，目前對于miRNA-靶基因-生物學(xué)功能的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識還不足。未來將miRNA 作為調(diào)控家畜肉品質(zhì)的靶點，甚至作為生物學(xué)標(biāo)記治療代謝性疾病具有十分廣闊的前景。