陳楠生

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心,山東 青島 266071)

有害藻華(harmful algal blooms)是由于藻類快速繁殖和累積造成的自然生態(tài)現(xiàn)象, 可能具有災(zāi)難性的生態(tài)或經(jīng)濟(jì)后果, 比如導(dǎo)致海洋動(dòng)、植物死亡、海洋食品污染、海洋食物鏈的改變, 以及旅游資源的破壞等[1-2]。近年來, 國(guó)內(nèi)外赤潮發(fā)展具有新特點(diǎn), 包括暴發(fā)規(guī)模加大、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、致災(zāi)效應(yīng)加重和全球擴(kuò)張明顯[3]。我國(guó)海岸線長(zhǎng), 近岸海域面積大, 包括渤海、黃海、東海和南海, 有害藻華是我國(guó)海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的問題之一[1]。對(duì)于引發(fā)有害藻華的物種, 應(yīng)用傳統(tǒng)的基于形態(tài)分類的研究方法, 積累了大量的數(shù)據(jù)。然而基于形態(tài)分類的研究方法有很大的局限性。首先, 需要研究人員具有專業(yè)經(jīng)驗(yàn), 來準(zhǔn)確分辨不同藻類物種; 其次, 藻類細(xì)胞在分析過程中的形態(tài)穩(wěn)定性的不同可能造成結(jié)果的偏差; 另外, 細(xì)胞太小的微微藻往往會(huì)被忽略; 還有, 形態(tài)相似的隱存種得不到準(zhǔn)確區(qū)分[4-6]。

分子分析方法的引入大大加強(qiáng)了我們對(duì)包括有害藻華物種在內(nèi)的浮游植物生物多樣性的理解[7]。早在20多年前, 美國(guó)和法國(guó)科學(xué)家分別通過克隆測(cè)序葉綠體16S rDNA和核糖體18S rDNA序列鑒定到海水中存在多種真核浮游植物[5,8-9](圖 1)。隨后, 18S rDNA被作為分子標(biāo)記研究自然海域浮游植物的組成,并發(fā)現(xiàn)兩類與甲藻進(jìn)化關(guān)系較近的生物類群, 即海洋alveolateⅠ和 alveolateⅡ[10-11], 并確認(rèn)了 AlveolateⅠ和AlveolateⅡ都是寄生性甲藻[12]。

這些基于DNA分子標(biāo)記擴(kuò)增、測(cè)序研究野外樣本的方法迅速顯示出強(qiáng)大的潛力, 并逐步演變成為宏條形碼分析[13], 即針對(duì)包括很多物種的自然樣本,而不是單一物種為研究對(duì)象的基因組研究。宏條形碼分析已廣泛應(yīng)用于包括有害藻華在內(nèi)的浮游植物的生態(tài)學(xué)研究[14]。宏條形碼分析策略與基于全基因組測(cè)序的宏基因組學(xué)分析(metagenomics analysis)相輔相成, 宏條形碼分析關(guān)注物種組成及相對(duì)豐度,宏基因組學(xué)則重點(diǎn)關(guān)注基因功能。2015年美國(guó)《科學(xué)》雜志發(fā)表了系列利用宏條形碼分析的文章, 報(bào)道Tara Oceans國(guó)際合作項(xiàng)目的研究成果(圖2)[15]。通過對(duì)采集到的334個(gè)浮游植物樣本針對(duì)18S rDNA V9進(jìn)行擴(kuò)增和高通量測(cè)序, 得到了150 000個(gè)可操作分類單元(operational taxonomy units, OTUs), 其中1/3未能比對(duì)到已知物種, 說明海洋中存在大量的尚未得到描述的真核物種。Tara Oceans數(shù)據(jù)的分析結(jié)果揭示了藻類物種的全球分布格局, 包括藻類物種的生物地理學(xué)[16-22]、季節(jié)性變化規(guī)律[23-24]和共生性[25]。另外一個(gè)有代表性的宏條碼研究是由國(guó)際海洋采樣日聯(lián)盟(Ocean Sampling Day Consortium)發(fā)起的國(guó)際合作項(xiàng)目[26-27]。這個(gè)由歐盟資助的微生物B3項(xiàng)目發(fā)起的國(guó)際組織意在通過國(guó)際合作, 在同時(shí)間獲取海洋樣本, 完成測(cè)序分析。迄今, 海洋采樣日聯(lián)盟已經(jīng)協(xié)同完成了多個(gè)重大項(xiàng)目, 比如, 通過對(duì)全球141個(gè)采樣位點(diǎn)樣本的同時(shí)采樣, 和18S rDNA V4序列的測(cè)序, 首次完成了大規(guī)模海洋綠藻的全球分布分析[26]。近年來, 隨著DNA測(cè)序技術(shù)在海洋生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用,DNA測(cè)序正在代替?zhèn)鹘y(tǒng)技術(shù), 逐步被應(yīng)用于監(jiān)測(cè)海洋生態(tài)狀況[28]。另外, 國(guó)際合作項(xiàng)目全球微生物組計(jì)劃(Earth Microbiome Project)也展開了較多的海洋浮游植物的宏條形碼分析[29]。

圖1 宏條形碼分析的里程碑事件Fig. 1 Milestones in metabarcoding analysis

圖2 Tara Oceans項(xiàng)目-浮游植物與其他浮游生物的豐富度分布格局[15]Fig. 2 Tara Oceans Project： Abundance profile of phytoplankton and other plankton

宏條形碼分析方法引入我國(guó)以后, 促進(jìn)了針對(duì)各海域的有害藻華研究[30-33]。特別是近年來, 宏條形碼研究越來越多, 包括對(duì)渤海[34-38]、黃海、東海[39-40]、南海[41-43]、膠州灣[4,44]、北部灣、長(zhǎng)江口、珠江口[45-46]等的研究, 取得了顯著進(jìn)展。本綜述系統(tǒng)介紹這些進(jìn)展, 并分析存在的機(jī)會(huì)與挑戰(zhàn)。

1 宏條形碼分析技術(shù)

1.1 條形碼的選擇

宏條形碼分析通用的條形碼包括核糖體 rRNA基因18S rDNA、28S rDNA、 ITS序列、葉綠體基因rbcL和16S rDNA[47]和線粒體基因CO1等。這些通用分子標(biāo)記的最大優(yōu)勢(shì)在于它們的通用性, 即可以通過設(shè)計(jì)通用 PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序, 并且可以用于分析絕大多數(shù)的浮游植物, 包括有害藻華物種。早期的宏條形碼分析是通過克隆、測(cè)序策略完成的, 即擴(kuò)增全長(zhǎng)或局部的通用分子標(biāo)記, 克隆, 然后挑選單克隆, 通過第一代DNA測(cè)序(即桑格測(cè)序)技術(shù)讀取每一條條形碼的序列。隨著第二代DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn), 高通量、低成本的第二代DNA測(cè)序技術(shù)逐步取代低通量、高成本的第一代DNA測(cè)序技術(shù), 變成宏條形碼主流測(cè)序技術(shù)。由于第二代DNA測(cè)序技術(shù)的讀長(zhǎng)比較短, 因此基于第二代DNA測(cè)序技術(shù)的宏條形碼分析往往針對(duì)上述通用分子標(biāo)記的局部, 比如, 18S rDNA的V4區(qū)域[4]或V9區(qū)域[15], 28S rDNA的D1-D2區(qū)域[48]等特異性條形碼。目前, 第二代DNA測(cè)序技術(shù)是開展宏條形碼研究的主流, 但是, 由于二代DNA測(cè)序得到的DNA片段往往不足以分辨不同物種, 基于第二代DNA測(cè)序的宏條形碼分析不能充分回答很多問題。隨著第三代單分子DNA測(cè)序技術(shù)的日益成熟, 特別是基于PacBio測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序通量的不斷增加, 成本逐步下降, 越來越多的人開始嘗試將第三代DNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于宏條形碼分析[49]。

1.2 宏條碼分析方法: 從OTU分析到ASV分析

很長(zhǎng)一段時(shí)間以來, 宏條形碼分析的通常分析思路是通過分子標(biāo)記(即條形碼)擴(kuò)增和測(cè)序后, 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行聚類分析, 生成可操作分類單元(OTU)。每一個(gè)可操作分類單元OTU包括樣本中相差很小(通常在3%以內(nèi))的序列。OTU分析方法被廣泛用于分析宏條形碼研究項(xiàng)目。通常, 人們期待OTU 具有如下兩方面的功能： 其一, 把針對(duì)某種分子標(biāo)記的環(huán)境樣本的高通量測(cè)序結(jié)果轉(zhuǎn)換成物種分類信息, 并且不同的相似性對(duì)應(yīng)不同的分類單元;其二, 通過把相似的序列聚類起來, 從而減少測(cè)序錯(cuò)誤帶來的副作用, 降低對(duì)生物多樣性分析和物種組成分析的負(fù)面影響[50]。然而, OTU并不能夠很好地執(zhí)行上面的兩個(gè)功能。OTU并沒有具體的分類信息,不能與物種進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)。而且, 模擬研究發(fā)現(xiàn)OTU聚類分析得到的 OTU數(shù)目往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于物種數(shù)目, 表明OTU聚類分析具有很高的假陽性[50]。同時(shí), 由于OTU聚類分析忽視了現(xiàn)代測(cè)序結(jié)果中的質(zhì)量信息, 浪費(fèi)了區(qū)分更精細(xì)的序列多樣性的可能性,人為限制了OTU聚類分析的分辨率, 表明OTU聚類分析還具有很高的假陰性[51-52]。

OTU聚類分析的另外一個(gè)嚴(yán)重的弊端是分析結(jié)果不能用于比較不同樣本的物種組成。無參考數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs(de novoOTUs)分析結(jié)果非常依賴樣本的組成(圖3), 因此, 兩個(gè)不同樣本的OTU聚類分析結(jié)果不能進(jìn)行比較。為了支持不同樣本聚類分析結(jié)果的可比性, 人們提出了“封閉式”有參OTUs(closedreference OTUs)的概念, 即在聚類過程中, 根據(jù)相似性, 序列都圍繞參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列進(jìn)行聚類,得到 OTUs。因此, 只要利用相同的參考數(shù)據(jù)庫(kù), 分析得到的 OTUs是可以比較的。這個(gè)分析思路的局限是, 參考數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在但是樣本中存在的數(shù)據(jù)就不能得到聚類(圖 3)。因此, 封閉式有參 OTUs分析受到參考數(shù)據(jù)庫(kù)的局限[50]。并且, 參考數(shù)據(jù)庫(kù)的任何變化比如數(shù)據(jù)庫(kù)升級(jí)都會(huì)影響分析結(jié)果。

圖3 基于ASV的分析在逐步取代基于OTU的分析[50]Fig. 3 Replacement of OTU-based analysis by ASV-based analysis

為了解決上述OTU相關(guān)的問題, 人們提出了基于擴(kuò)增子序列變異(amplicon sequence variant, ASV)概念。ASV算法的基本假設(shè)是真實(shí)的DNA序列在測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于測(cè)序誤差, 不依賴閾值區(qū)分不同的ASV[50]。因此, 來自不同樣本的ASV序列具有可比性[50]。

基于這個(gè)概念的宏條形碼分析具有既不依賴參考數(shù)據(jù)庫(kù), 也不依賴相似性閾值的優(yōu)點(diǎn)。因此, 與基于OTU概念的分析方法相比, 基于ASV的宏條形碼分析方法具有很高的優(yōu)越性, 可以捕獲樣本中所有的變異, 并且可以用于比較分析不同樣本的物種組成(圖3)。由于基于ASV的分析更加準(zhǔn)確, 分析結(jié)果可以用于比較不同樣本的物種組成, 可以重復(fù)使用,并且更加全面, 基于OTU的宏條形碼分析方法在逐步被基于 ASV的方法替代[50,53]。常用的用于分析ASV的方法包括DADA2[51], Deblur[54]和denoise[55]。

DADA算法, 即不同擴(kuò)增子去噪算法(Divisive Amplicon Denoising Algorithm), 最早發(fā)表于2012年[52]。DADA是在AmpliconNoise算法[55]的基礎(chǔ)上開發(fā)出來的。DADA的優(yōu)勢(shì)在于不需要訓(xùn)練數(shù)據(jù)集, 充分利用序列豐度信息, 通過誤差建模, 評(píng)估誤差參數(shù), 最后推測(cè)出樣本測(cè)序結(jié)果中的序列類型。2016年DADA2發(fā)表, 特別增加了針對(duì)Illumina擴(kuò)增子的測(cè)序質(zhì)量模型, 并開發(fā)了R軟件包, 全部分析可以在R環(huán)境下運(yùn)行, 包括過濾、去重復(fù)、推測(cè)序列信息、鑒定嵌合體、結(jié)合雙端測(cè)序結(jié)果等[51]。最近, 我們成功利用DADA2方法分析膠州灣2019年冬季航次采集的樣本, 分析發(fā)現(xiàn)了大量浮游植物, 其中包括首次在膠州灣發(fā)現(xiàn)的有害藻華物種, 以及大量的寄生性甲藻, 并評(píng)估了浮游植物之間的互作情況[4]。

2 我國(guó)海域有害藻華物種的宏條形碼分析進(jìn)展

2.1 近岸海域的宏條形碼分析

渤海是我國(guó)唯一的內(nèi)海, 具有半封閉性, 包括遼東灣、渤海灣和萊州灣, 是一個(gè)重要的產(chǎn)卵場(chǎng)和索餌場(chǎng)(圖 4)[56]。由于陸生污染物排放和富營(yíng)養(yǎng)化,赤潮和褐潮暴發(fā)頻率和強(qiáng)度均呈上升趨勢(shì)[56-57]。基于形態(tài)學(xué)的鏡檢的研究發(fā)現(xiàn)渤海代表性有害藻華物種, 包括夜光藻(Noctiluca scintillans)、原甲藻(Prorocentrumsp.)、血紅哈卡藻(Akashiwo sanguinea)[58], 丹麥細(xì)柱藻(Leptocylindrus danicus)[59]、柔軟擬菱形藻(Pseudo-nitaschia delicatissima)[59]、浮動(dòng)彎角藻(Eucampia zoodiacus)[59]、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)[59]、諾氏海鏈藻(Thalassiosira nordenskioldi)[59]、旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)[59]、柔弱幾內(nèi)亞藻(Guinardia delicatula)[60]、多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)[61]和有害甲藻(Stoeckeria algicida)[36,62-63]?；跀U(kuò)增測(cè)序 18S rDNA V4的宏條形碼研究證實(shí)褐潮的致災(zāi)藻華物種是抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)[64-65]。通過對(duì)沉積物樣本進(jìn)行18S rDNA V9區(qū)擴(kuò)增測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)了抑食金球藻是一個(gè)本地種, 并且是一個(gè)在全世界范圍內(nèi)廣泛分布的有害藻華物種[66]。除此之外, 宏條形碼研究還發(fā)現(xiàn)渤海還存在很多豐度較低但是又具有暴發(fā)潛力的有害藻華物種[34,36,38,67-69]。

黃海是一個(gè)陸緣海(marginal sea), 具有比較復(fù)雜的海流包括黃海冷水團(tuán)(Huanghai Cold Water Mass,HCWM), 黃海暖流(Huanghai Warm Current, HWC),以及長(zhǎng)江沖淡水(Changjiang River Diluted Water,CDW)(圖 4)[70]。蘇北淺灘的浮游植物以硅藻為主[71]。孢囊分析發(fā)現(xiàn)很多有害藻華物種的孢囊, 包括具刺膝溝藻(Gonyaulax spinifera)和多邊舌甲藻(Lingulodinium polyedrum), 鏈狀/塔馬亞歷山大藻(Alexandrium catenella/tamarense), 微小/相似亞歷山大藻(Alexandrium minutum/affine)和鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum)[72]。基于18S rDNA V4區(qū)的宏條形碼比較分析發(fā)現(xiàn)南黃海與北黃海海域的綠藻與硅藻具有很高的豐度, 可以支撐海岸帶的食物鏈, 特別是海洋經(jīng)濟(jì)貝類的養(yǎng)殖[73]。

位于我國(guó)、韓國(guó)、日本之間的東海是一個(gè)很大的大陸架(continental shelf), 也是一個(gè)高產(chǎn)漁場(chǎng), 其浮游生物受長(zhǎng)江沖淡水以及黑潮(Kuroshio Current)的影響比較大[74-75]。東海的長(zhǎng)江口附近海域是赤潮暴發(fā)最顯著的位置[1], 對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境和公共衛(wèi)生產(chǎn)生極大影響[76]。迄今對(duì)于東海浮游植物及有害藻華物種的研究以浮游植物色素研究[74]、流式細(xì)胞研究[75]和形態(tài)觀察[77-79]為主。東海有害藻華物種中，東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)[80-83]和米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)[84-85]占主導(dǎo)地位。最近在東海發(fā)現(xiàn)了指狀卡羅藻(Karlodinium digitatum)[84], 血紅哈卡藻的多個(gè)隱形種(cryptic species)[85], 以及尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)[86]。廈門島樣本進(jìn)行18S rDNA V9測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)底棲微型真核生物的多樣性比浮游的更高, 不同生境的物種分布模式以及影響分布模式的關(guān)鍵過程不同[39,87-88]。定鞭藻(haptophyte)是重要的浮游植物, 貢獻(xiàn)顯著的初級(jí)生產(chǎn)力, 也具有很高的生物多樣性[89-91]。通過利用定鞭藻特異性引物對(duì)18S rDNA V4區(qū)的擴(kuò)增測(cè)序及宏基因組分析證實(shí)了定鞭藻的分子多樣性水平, 并檢測(cè)到所有定鞭藻的主要分枝, 包括有害藻華物種球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)及三個(gè)同屬的棕囊藻物種(P. cordata,P. johnii,以及一個(gè)由序列ST3500.059代表的物種)[40]。

南海位于西太平洋北部, 是由多個(gè)國(guó)家圍繞的半封閉海域, 也是東南亞最大的半封閉的陸源海[92]。南海的主要有害藻華物種包括夜光藻、球形棕囊藻、中肋骨條藻、錐狀斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea)、赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、海洋卡頓藻(Chattonella marina)和米氏凱倫藻, 有害藻華極大地影響了南海海洋漁業(yè)。鏡檢和形態(tài)學(xué)分析顯示上升流對(duì)物種分布具有顯著的影響[93]。調(diào)查研究系統(tǒng)描述了南海浮游植物的組成和季節(jié)性變化, 其中也包括很多有害藻華物種[94-104]。衛(wèi)星遙感方法也跟蹤研究了南海赤潮[105-108], 特別是球形棕囊藻赤潮[109]的形成過程。宏條形碼分析揭示了香港水域微微藻生物的多樣性,遠(yuǎn)高于預(yù)期[110]。全長(zhǎng)18S rDNA擴(kuò)增, 克隆測(cè)序分析揭示了南海浮游植物的組成和分布格局, 發(fā)現(xiàn)甲藻是優(yōu)勢(shì)物種[111]?；贗TS2的宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)了珊瑚礁共生藻類的多樣性[41-43]。

2.2 海灣宏條形碼研究

膠州灣是黃海西部的一個(gè)半封閉性內(nèi)灣, 海灣與外?？梢赃M(jìn)行通暢的海水交換, 半交換周期為5天[112]。近 30年來, 經(jīng)濟(jì)活動(dòng)加快和人口增長(zhǎng)造成了膠州灣顯著的富營(yíng)養(yǎng)化[113-114]。長(zhǎng)時(shí)序遙感影像分析跟蹤膠州灣秋季葉綠素a濃度變化也顯示出膠州灣浮游植物群落的巨大變化[115]。膠州灣發(fā)現(xiàn)的甲藻孢囊中很多是有害藻華物種[116]。近年來, 膠州灣暖水性浮游植物、甲藻等浮游植物類群的數(shù)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)[117]。膠州灣有記錄的有害藻華物種高達(dá) 68種, 其中有多種在膠州灣引發(fā)過赤潮暴發(fā)[118]。常見有害藻華物種包括夜光藻[119-120]、浮動(dòng)彎角藻[121-124]和骨條藻[4]。在挪威海域引發(fā)大規(guī)模有毒藻華的有害藻華物種里氏金色藻(Chrysochromulina leadbeateri)也在膠州灣發(fā)現(xiàn)[125]。歷史調(diào)查報(bào)告中, 膠州灣的骨條藻大多被鑒定為中肋骨條藻[124]。最近我們針對(duì)18S rDNA V4的宏條碼分析, 加上對(duì)分離到的單細(xì)胞骨條藻株系的全長(zhǎng) 18S rDNA測(cè)序分析表明, 膠州灣的骨條藻為瑪氏骨條藻(Skeletonema marinoi)(圖4)[4]。針對(duì)rbcL的宏條形碼分析初步揭示了膠州灣浮游植物的生物多樣性, 春季代表性物種包括隱藻、定鞭藻和紅藻[44]。我們針對(duì)18S rDNA的 V4片段完成了宏條形碼分析, 分析了膠州灣冬季(2019年1月)的浮游植物組成及空間分布格局, 鑒定出膠州灣有 28個(gè)有害藻華物種, 并發(fā)現(xiàn)了膠州灣物種之間的可能互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖5)[4]。

北部灣位于南海西北部的一個(gè)半封閉式的海灣,熱帶季風(fēng)氣候, 曾經(jīng)被認(rèn)為是我國(guó)最后“一片干凈的海域”和高產(chǎn)漁業(yè)基地[126]。進(jìn)入19世紀(jì)90年代, 由于自然與人類活動(dòng)的雙重影響加劇[127], 北部灣海域暴發(fā)了一系列赤潮, 包括紅海束毛藻(Trichodesmium

圖4 膠州灣分離得到的骨條藻是瑪氏骨條藻[4]Fig. 4 Skeletonema marinoi is the primary Skeletonema species in the Jiaozhou Bay

圖5 膠州灣浮游生物之間的互作網(wǎng)絡(luò)[4]Fig. 5 Phytoplankton species-species interaction network in Jiaozhou Bay

erythraeum)赤潮和球形棕囊藻赤潮[128-130]。在過去30年里, 北部灣藻華暴發(fā)頻率、暴發(fā)持續(xù)時(shí)間和暴發(fā)規(guī)模都有顯著上升; 這些赤潮暴發(fā)事件不僅影響漁業(yè), 還對(duì)附近核電設(shè)施造成了巨大的威脅[126]。基于形態(tài)學(xué)分析在潿洲島附近鑒定出103種浮游植物,包括23種有害藻華物種, 其中球形棕囊藻、紅海束毛藻、菱形海線藻(Thalassionema nitzschioides)、旋鏈角毛藻和洛氏角毛藻(Chaetoceros lorenzianus)占優(yōu)勢(shì)[129]。利用流式細(xì)胞儀對(duì)北部灣9個(gè)航次的分析揭示了浮游植物在北部灣分布的時(shí)空變化[131], 浮游植物在夏季和秋季的豐度較高, 并集中于欽州灣附近以及雷州半島的西部。鏡檢發(fā)現(xiàn)欽州灣附近的浮游植物也比較豐富, 優(yōu)勢(shì)種包括球形棕囊藻和多種硅藻, 季節(jié)變化顯著[132]。球形棕囊藻囊體在北部灣也呈現(xiàn)出特定的時(shí)空分布, 高峰出現(xiàn)在12月到次年3月, 6月囊體很少[133]。迄今利用宏基因組學(xué)方法研究北部灣海域有害藻華物種的組成, 以及在有害藻華暴發(fā)過程中的動(dòng)態(tài)變化剛剛起步[134]。通過對(duì)2014—2015年度樣本的18S rDNA V4序列的測(cè)序, 重點(diǎn)分析了5種定鞭藻在北部灣北方的欽州灣分布情況, 發(fā)現(xiàn)與NO3-N正相關(guān), 并且發(fā)現(xiàn)水溫是決定球形棕囊藻豐度的主要原因。

2.3 河口宏條形碼研究

河口往往是多樣性程度很高的物理-生物互作生態(tài)系統(tǒng), 由于淡水注入(freshwater discharge)和咸水倒灌(salt water intrusion), 在河口附近鹽度和營(yíng)養(yǎng)鹽顯示很大的變化, 形成了河流-海域連續(xù)帶(river ocean continuum)。由于河口附近海域復(fù)雜的物理及生物地球化學(xué)互作, 使得針對(duì)這些水域浮游植物的生長(zhǎng)、分布規(guī)律, 以及有害藻華暴發(fā)的研究都具有很大的挑戰(zhàn)。

長(zhǎng)江口由于長(zhǎng)江徑流和泥沙入海, 以及復(fù)雜流系結(jié)構(gòu)和特殊地形, 形成了獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng), 也為赤潮暴發(fā)提供了條件[135-137]。長(zhǎng)江口及其鄰近海域受到長(zhǎng)江沖淡水和黑潮分支的雙重影響, 有害藻華的形成和演變不僅是陸源污染的“指示器”, 也是反映黑潮分支年際變異的“效應(yīng)器”[138]。從20世紀(jì)60年代到 90年代, 人為富營(yíng)養(yǎng)化(cultural eutrophication)越來越嚴(yán)重[139]。長(zhǎng)江口水域有多達(dá)68種有害藻華物種, 其中 5種有在長(zhǎng)江口暴發(fā)赤潮的記錄[140],以甲藻為主, 包括東海原甲藻[83]、米氏凱倫藻、亞歷山大藻(Alexandriumspp.)和夜光藻[138,141]。僅次于甲藻的是硅藻, 包括中肋骨條藻[141-143]。中肋骨條藻與夜光藻是常見和多發(fā)性赤潮物種, 二者經(jīng)常形成“混合型”赤潮[144]。長(zhǎng)江口內(nèi)到長(zhǎng)江口外的鹽度梯度和磷濃度嚴(yán)重影響有害藻華物種的分布[145]。迄今對(duì)長(zhǎng)江口水域的浮游植物及有害藻華物種的研究以基于形態(tài)分析的鏡檢為主[137,144,146-160]。比如, 對(duì)長(zhǎng)江口24個(gè)站位的72個(gè)樣本進(jìn)行的形態(tài)學(xué)鑒定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 鑒定出 94個(gè)物種, 包括骨條藻、東海原甲藻、米氏凱倫藻。發(fā)現(xiàn)不同有害藻華物種引起的不同類型的赤潮在長(zhǎng)江口的不同地點(diǎn)同時(shí)暴發(fā), 包括一個(gè)骨條藻赤潮, 兩個(gè)東海原甲藻赤潮, 以及一個(gè)米氏凱倫藻赤潮。另外發(fā)現(xiàn)從河口到離岸海域, 赤潮物種逐步從硅藻向甲藻、裸甲藻轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)[161]。此外近來硅藻有逐步被甲藻替代的趨勢(shì)[138]。針對(duì)18S rDNA的一個(gè)1 001 bp片段的宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江口水域存在較高的阿米巴藻Amoebophryidae[162]。針對(duì)18S rDNA V2-V3的宏條形碼研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江口附近海域包括很多的甲藻(特別是裸甲藻Gymnodinium和異冒藻Heterocapsa)和硅藻物種(特別是骨條藻)[163]。迄今為止, 還沒有利用宏條形碼方法分析長(zhǎng)江口中河流-海水連接帶的浮游植物的相關(guān)研究。

珠江口是一個(gè)位于我國(guó)南方亞熱帶河口, 連接南海北部大陸架, 其通量?jī)H次于長(zhǎng)江口, 全球排第13位。近30年來, 由于工業(yè)發(fā)展, 農(nóng)業(yè)活動(dòng), 以及城市化, 珠江口富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重[164]?；谠寮?xì)胞形態(tài)和熒光色素的分析, 發(fā)現(xiàn)珠江口的浮游植物中存在多種有害藻華物種, 包括無紋螺溝藻(Gyrodinium instriatum)、中肋骨條藻、浮動(dòng)彎角藻、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、三角棘原甲藻(Prorocentrumtriestinum)、叉角藻(Ceratium furca)、血紅哈卡藻、鏈狀裸甲藻、哈曼褐色多溝藻(Pheopolykrikos hartmannii)、雙胞旋溝藻(Cochlodinium geminatum)等[165-173]。珠江口浮游植物組成和動(dòng)態(tài)分布的季節(jié)性變化, 受包括風(fēng)暴在內(nèi)的環(huán)境因子的影響[172,174-175]。迄今珠江口的宏條形碼研究不多?；趓bcL的宏條形碼的分析展示了珠江口到南海的浮游植物組成, 以及受營(yíng)養(yǎng)鹽和鹽度梯度影響的分布方式[46]。珠江口河流-海域連接帶的浮游生物在豐水(夏季)和枯水(冬季)之間差異的宏條形碼研究創(chuàng)造性地利用了DNA與RNA的不同特性及其反映的不同狀態(tài), 比較研究了浮游生物的豐度及活性[176]。

3 機(jī)遇與挑戰(zhàn)

3.1 宏條形碼分析的穩(wěn)步發(fā)展

由于DNA測(cè)序技術(shù)的快速提升, 生物信息學(xué)分析方法的迅速跟進(jìn), 宏條形碼分析也得到了顯著的完善, 經(jīng)歷了三個(gè)主要發(fā)展過程： (1)基于對(duì)野外樣本的特定分子標(biāo)記(即條形碼)的 PCR擴(kuò)增、分子克隆和第一代DNA測(cè)序技術(shù)的低通量分析。這個(gè)階段的主要分析方法是將測(cè)序結(jié)果與已知物種的序列合并在一起, 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹, 分析野外樣本的物種組成[10-11,64,162]。(2)基于對(duì)野外樣本的特定分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增, 對(duì)測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行高通量(第二代DNA測(cè)序技術(shù))測(cè)序, 利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行 OTU分析,解析野外樣本的物種組成及相對(duì)豐度[36,44,163,176-177]。(3)基于PCR擴(kuò)增、第二代或第三代DNA測(cè)序技術(shù),利用ASV分析物種組成及相對(duì)豐度[4]。

3.2 宏條形碼分析的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)

與基于形態(tài)觀察和分類的研究方法相比, 宏條形碼研究方法, 具有多方面的顯著優(yōu)勢(shì)。(1)分辨率比較高, 能夠區(qū)分隱存種(cryptic species)。在宏條形碼分析中, 分子標(biāo)記中任何差別, 比如只要有單堿基的差別, 都可以通過DNA測(cè)序和生物信息學(xué)比較檢測(cè)到。因此分辨率比較高。相比而言, 基于形態(tài)觀察的分析方法只能夠分辨出具有顯著區(qū)別的形狀。因此, 基于形態(tài)分析不能分辨的很多不同隱存種,都依據(jù)分子標(biāo)記信息區(qū)分成不同的物種。比如塔瑪亞歷山大藻“復(fù)合種”(“Alexandrium tamarensespecies complex”)根據(jù)分子標(biāo)記信息被區(qū)分為 5種藻：A. fundyense、A. mediterraneum、A. tamarense、A. australiense和A. pacificum[178]。(2)適于開展定量分析。在高分辨率基礎(chǔ)上, 還可以通過測(cè)序結(jié)果分析、跟蹤每個(gè)不同分子標(biāo)記的數(shù)量, 從而能夠定量分析包括有害藻華物種(以及所有浮游植物、浮游動(dòng)物)相對(duì)豐度在內(nèi)的各種多樣性指標(biāo), 更加準(zhǔn)確地計(jì)算浮游植物群落的α多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù)[179]。(3)宏條形碼分析方法比較容易標(biāo)準(zhǔn)化, 因此比較容易學(xué)習(xí)。相反, 基于形態(tài)學(xué)的分析方法的掌握需要長(zhǎng)時(shí)間的專業(yè)訓(xùn)練和積累才能夠獲得對(duì)不同物種的認(rèn)識(shí), 導(dǎo)致針對(duì)相同樣本, 不同研究者可能得到不同的分析結(jié)果, 客觀性比較差。(4)比較容易規(guī)?；? 采樣標(biāo)準(zhǔn)化的宏條形碼方法分析我國(guó)各個(gè)不同海域,以及相同海域的不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣本, 并且分析結(jié)果的可比性比較強(qiáng)。相比而言, 基于形態(tài)學(xué)的分析方法由于很大程度上依賴研究者的經(jīng)驗(yàn)和判斷能力,不同項(xiàng)目的研究結(jié)果往往可比性較低。因此, 宏條形碼分析方法開始應(yīng)用于研究我國(guó)近岸海域的浮游植物組成以及動(dòng)態(tài)變化, 為研究有害藻華的暴發(fā)機(jī)理提供了很好的支撐。

3.3 宏條形碼分析帶來的機(jī)遇

可以期待, 宏條形碼分析方法將在我國(guó)有害藻華研究中起越來越重要的作用。(1)增加不同項(xiàng)目之間的可比性。迄今為止的基于形態(tài)觀察的浮游植物和有害藻華物種調(diào)查研究雖然取得了巨大的成就,描繪出我國(guó)近岸海域浮游植物和有害藻華物種的組成和分布。然而, 這些組成和分布研究結(jié)果大多是定性的。未能實(shí)現(xiàn)定量分析的原因有很多, 比如, 采集體積 不定量(網(wǎng)采), 研究者的經(jīng)驗(yàn)和特長(zhǎng)不同, 對(duì)相同海域的物種鑒定結(jié)果可能不一致, 導(dǎo)致不同研究者獲得的結(jié)果可比性差?；诤陾l形碼的分析將大大提高不同項(xiàng)目之間的定量可比性。(2)發(fā)掘新物種,研究物種的生物地理學(xué)。通過采用規(guī)范性采樣程序,開展高通量測(cè)序, 宏條形碼分析可以發(fā)現(xiàn)曾經(jīng)被忽視的浮游植物物種。很多微微型有害藻華物種, 光學(xué)顯微鏡不能充分發(fā)現(xiàn)和區(qū)分, 常常被忽略。比如, 北戴河海域的抑食金球藻正是通過宏條形碼分析得到證實(shí)[64]。抑食金球藻的廣泛分布格局也是由宏條碼分析方法實(shí)現(xiàn)[66]。宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)海水中大量存在的寄生性甲藻[180]。(3)浮游植物-浮游植物互作。海洋生態(tài)系統(tǒng)中的浮游植物與其他種類浮游植物、浮游動(dòng)物、浮游微生物之間都存在著多種多樣的相互作用,包括捕食(predator-prey)、共生(host-symbiont)和寄生(host-parasite)[4,181]。

3.4 宏條形碼分析的挑戰(zhàn)

宏條形碼分析具有極大的競(jìng)爭(zhēng)力, 將在我國(guó)浮游植物研究, 特別是有害藻華物種的分布和豐度的動(dòng)態(tài)研究中起越來越重要的作用。為了確保宏條形碼分析方法釋放更大的威力, 需要突破兩方面的挑戰(zhàn)[182]。

第一個(gè)挑戰(zhàn)是高分辨率分子標(biāo)記(即條形碼)的選擇和PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)。(1)選擇對(duì)研究對(duì)象具有代表性或特異性, 具有高分辨率的分子標(biāo)記。宏條形碼分析中通常使用的分子標(biāo)記包括核糖體RNA基因18S rDNA和28S rDNA, ITS, 線粒體基因CO1,以及葉綠體基因rbcL。使用這些通用分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)是它們都有通用 PCR擴(kuò)增引物, 并得到充分驗(yàn)證和應(yīng)用, 具有廣泛的可比性。然而, 這些分子標(biāo)記也有其局限性, 它們往往過于保守, 分辨率有限, 不能夠有效區(qū)分很多同屬物種, 更不能夠區(qū)分同種的不同遺傳株系。除此之外, 這些通用分子標(biāo)記在基因組中往往以多拷貝存在, 而且拷貝數(shù)在不同物種中具有拷貝數(shù)多樣性, 因此這些分子標(biāo)記的測(cè)序結(jié)果不能簡(jiǎn)單解析其在樣本中的相對(duì)豐度。最近證據(jù)表明,有些通用分子標(biāo)記在同一基因組中的多拷貝之間具有序列多樣性, 影響了這些分子標(biāo)記應(yīng)用價(jià)值[183]。為了提升分子標(biāo)記對(duì)不同物種的分辨率, 可以采用第三代DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序樣本的全長(zhǎng)分子標(biāo)記。也可以通過比較分析, 開發(fā)其他分子標(biāo)記。比如線粒體、葉綠體或核基因組中的高變異區(qū)作為分子標(biāo)記。通用分子標(biāo)記 18S rDNA的通用擴(kuò)增引物不能很好擴(kuò)增定鞭藻的信息, 改用 28S rDNA作為分子標(biāo)記,擴(kuò)增到豐富的定鞭藻的信息[48]。(2)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物, 降低其偏好性。如果PCR擴(kuò)增引物具有偏好性,測(cè)序結(jié)果就不能夠如實(shí)反映樣本的組成以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。因此, 為了獲得較好的結(jié)果, 選擇適當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記, 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增引物至關(guān)重要。

第二個(gè)挑戰(zhàn)是分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性。針對(duì)浮游植物和有害藻華物種的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)包括SILVA[184]和PR2[185]。在通常的宏條形碼分子中, 超過 50%(或更多)的測(cè)序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有對(duì)應(yīng)的參考序列, 因此得不到準(zhǔn)確注釋。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)不斷更新, 這種情況在逐步得到改善。不過, 我國(guó)海域中有很多特有的浮游植物和有害藻華物種。為了獲得對(duì)這些物種的覆蓋, 我們需要針對(duì)中國(guó)特異性物種,充實(shí)相應(yīng)的分子標(biāo)記, 完善數(shù)據(jù)庫(kù), 促進(jìn)對(duì)我國(guó)海域樣本宏條形碼分析結(jié)果的解讀。隨著這些挑戰(zhàn)性問題的解決, 可以預(yù)期宏條形碼方法將會(huì)更加有效應(yīng)用于有害藻華物種的研究。

此外, 宏條形碼分析與其他組學(xué)分析技術(shù)比如宏基因組學(xué), 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué), 宏蛋白組學(xué)和宏代謝組學(xué)具有互補(bǔ)的特性。宏條形碼分析集中解析物種組成和相對(duì)豐度, 宏基因組學(xué)分析基因組功能, 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白組學(xué)分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分析基因表達(dá)以及對(duì)環(huán)境的響應(yīng), 宏代謝組學(xué)分析環(huán)境一般的代謝產(chǎn)物。這些組學(xué)技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用將更能發(fā)揮其重要性。