杜麗霞，陳明，朱文濤，姜子濤,2*

(1.天津天獅學院 食品工程學院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134)

排草具有濃郁的香氣，是近年來在麻辣火鍋、干鍋、鹵菜中普遍使用的一種調(diào)味香料，具有增香、去腥和防腐的作用。排草又名排草香、香排草、香草等，正名為細梗香草(LysimachiacapillipesHemsl.)，報春花科珍珠菜屬多年生草本植物[1,2]。在我國的貴州、四川、湖北、江西、廣東等地以及印度、斯里蘭卡、緬甸等地均有分布。排草的化學成分主要為皂苷[3-5]、揮發(fā)油[6]和黃酮。排草揮發(fā)油可用于調(diào)配化妝品及煙草用香精。排草中的皂甙(主要是三萜類皂甙)具有非常強的抗腫瘤活性。排草作為中草藥已有兩千多年的歷史，具有很高的藥用價值，可用于治療水腫、浮腫、腫瘤等疾病。國內(nèi)外對排草化學成分的研究主要集中在皂甙的分離鑒定以及皂甙的抗腫瘤活性[7-14]，而關于揮發(fā)油和黃酮類化合物的研究則極少報道。由從前面的研究可知，排草中的黃酮主要是山奈酚和槲皮素兩大類[15,16]。已報道的排草黃酮提取方法是以水或乙醇作為提取劑的傳統(tǒng)提取法[17]，前者由于提取劑極性較強，存在著黃酮提取不完全、雜質多的問題；同時這兩種方法均存在提取時間長、提取效率低等缺陷。

本研究采用超聲波輔助提取法提取排草黃酮，通過單因素試驗和正交法確定了排草黃酮的最佳提取條件，并利用大孔吸附樹脂對所獲得的排草黃酮進行提純；測定了排草黃酮清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和抗氧化活性，并與食用抗氧化劑維生素C(Vc)進行了比較，為排草及黃酮的進一步開發(fā)和利用提供了可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

排草樣品：購于天津市武清藥店，粉粹后過40目篩，置于廣口瓶中避光保存。蘆丁：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：美國Sigma公司；Vc：北京譜析科技有限公司；乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司；DM130、D101、AB-8、HPD-600和HPD-100 5種大孔樹脂：天津南大樹脂科技有限公司提供，使用前按照文獻[18]進行預處理；試驗用水均為去離子水，所用試劑均為分析純。

U3900型紫外可見分光光度計 日立高新技術公司；UV1000型紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；YM-650CT型多用途恒溫超聲提取儀 上海豫明儀器有限公司；LGJ-10NS型冷凍干燥機 北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 排草黃酮的提取

準確稱取一定質量的排草粉末，置于具塞三角瓶中，按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，加蓋后置于超聲波儀中，設定好提取溫度和提取時間后進行提取，最后將提取液在4000 r/min轉速下離心20 min，取上清液備用。

1.2.2 排草黃酮得率的測定

準確稱取蘆丁標準品15 mg，加甲醇溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容并混勻，配制成150 μg/mL的蘆丁標準溶液，然后按照參考文獻[19]中的方法進行顯色和測定，繪制蘆丁標準曲線。

準確吸取制得的排草黃酮溶液1 mL置于25 mL容量瓶中，從加水至6 mL開始，按照參考文獻[19,20]的方法進行顯色測定，將測得的吸光度值帶入上述的蘆丁標準曲線中，然后按照此式計算黃酮得率：黃酮得率(%)=C·V/10M。式中：C為由線性回歸方程計算出的黃酮提取液濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為樣品質量，g。

1.2.3 排草黃酮提取條件的優(yōu)化

單因素試驗：選取乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時間4個因素，每個因素選取5個水平，進行單因素試驗，確定每個因素中提取排草黃酮的最優(yōu)水平。正交試驗：根據(jù)單因素試驗中確定的最優(yōu)水平，設計四因素三水平的正交試驗L9(34)，通過正交試驗得到排草黃酮的最佳提取工藝條件[21]。

1.2.4 排草黃酮純化條件的優(yōu)化

將經(jīng)活化后的DM130、D101、AB-8、HPD-600和HPD-100 5種大孔樹脂分別裝入玻璃層析柱中，然后通過吸附和解吸試驗篩選出純化效果最好的一種，最后對上樣液pH、上樣流速、洗脫液乙醇濃度及洗脫流速4個單因素進行優(yōu)化[22]，得到排草黃酮的最佳純化條件。

1.2.5 排草黃酮抗氧化活性

將經(jīng)過純化后的排草黃酮凍干粉配制成10～100 μg/mL的溶液，從不同濃度的排草黃酮溶液中各取0.6 mL分別放于10支編號的比色管中，各加入6 mL 0.06 mmol/L DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，在507 nm下測定吸光度值，記作Ar(1～10)；取0.6 mL 80%乙醇溶液，再加6 mL 0.06 mmol/L DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，測定吸光度值，記作Ac；從不同濃度的排草黃酮溶液中各取0.6 mL分別放于10支編號的比色管中，各加入6 mL 80%乙醇溶液，混勻后避光靜置30 min，測定吸光度值，記作Ax(1～10)。按下列公式計算各濃度排草黃酮溶液的清除率。以橫坐標為樣品濃度、縱坐標為清除率，繪制純化后的排草黃酮清除率曲線，并按照此式計算清除率IC50值：清除率(%)=(Ac-Ar+Ax)/Ac×100。

同上，繪制Vc對DPPH自由基的清除率曲線，計算IC50值，將兩者的半數(shù)清除率進行比較，評價純化后排草黃酮的清除自由基能力及抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

按照1.2.2的方法測得的蘆丁標準曲線，其線性回歸方程為y=0.329x+0.0088(R2=0.9995)，線性關系良好，排草提取液黃酮濃度均用此方程進行計算。

2.2 提取排草黃酮的單因素試驗結果

排草黃酮的單因素試驗結果見圖1。

圖1 單因素對排草黃酮得率的影響Fig.1 Effect of single factors on the yield of flavonoids from L. capillipes

由圖1中(a)可知，當乙醇濃度為60%時，排草黃酮的得率最高；當乙醇濃度低于60%時，部分醇溶性的黃酮未被充分提取出來；當乙醇濃度高于60%時，部分水溶性的黃酮未被充分提取出來，因此選擇60%為最佳乙醇濃度。由圖1中(b)可知，隨著料液比增大，排草黃酮得率增高，當料液比在1∶20～1∶50之間時，黃酮得率增高速度大幅減緩，在保障黃酮得率的同時，為了減少提取劑的用量，降低成本，保護環(huán)境，最終選擇1∶30為最佳的料液比。由圖1中(c)可知，隨著提取時間增長，排草黃酮得率增高，當提取時間為80～100 min時，黃酮得率增高不明顯。為提高提取效率，選擇80 min為最佳的提取時間。與文獻[17]比較可知，超聲波輔助提取能夠明顯提高黃酮的提取效率，提取時間較傳統(tǒng)的溶劑提取法縮短了一半以上。這是因為超聲波能促使植物的細胞組織破壁或變形，使黃酮成分提取更充分。由圖1中(d)可知，提取溫度為50 ℃時，排草黃酮的得率最高；當提取溫度較低時，分子運動較慢，不利于黃酮的溶出；當提取溫度過高時，黃酮類化合物會受熱分解而損失掉，因此選擇50 ℃為最佳提取溫度。

2.3 提取排草黃酮的正交試驗結果

正交試驗結果見表1。

表1 正交試驗結果Table 1 Orthogonal test results

由表1可知，影響排草黃酮得率的因素主次為：料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時間。正交試驗所得排草黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度50%，料液比1∶40(g/mL)，提取時間80 min，提取溫度50 ℃。在此條件下平行提取3次，得到的排草黃酮得率分別為3.14%、3.18%、3.15%，平均值為3.16%。

2.4 大孔樹脂的篩選

2.4.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸

5種不同類型的大孔樹脂對排草黃酮的吸附和脫附結果見表2。

表2 5種大孔樹脂對排草黃酮的靜態(tài)吸附率與解吸率Table 2 Static adsorption rate and desorption rate of fivemacroporous resins on flavonoids from L. capillipes %

由表2可知，型號為HPD-100的大孔樹脂對排草黃酮的吸附和脫附效果均最好，因此選擇型號為HPD-100的大孔樹脂對排草黃酮進行純化。

2.4.2 吸附及解吸動力學曲線

由圖2吸附動力學曲線中可知，0～70 min時 HPD-100大孔樹脂對排草黃酮的吸附速度比較快，而在70～250 min吸附速度逐漸放緩并趨于平穩(wěn)，此時大孔樹脂吸附量達到飽和，計算出HPD-100大孔樹脂對排草黃酮的最大吸附量為14.58 mg/g濕樹脂。由圖2解吸動力學曲線中可知，0～60 min時乙醇溶液對排草黃酮解吸速度較快，但60 min之后趨于平穩(wěn)。

圖2 HPD-100樹脂對排草黃酮的吸附及解吸動力學曲線Fig.2 Adsorption and desorption kinetic curves of HPD-100resin on flavonoids from L. capillipes

2.5 排草黃酮純化條件的優(yōu)化

2.5.1 上樣液pH值及洗脫液乙醇溶液濃度的確定

由圖3中(a)可知，HPD-100大孔樹脂的吸附效果受上樣液pH值的影響較大，上樣液pH為8時吸附效果最差，這是因為排草黃酮具有多酚結構，在堿性環(huán)境中，黃酮分子羥基中的H+離去，黃酮化合物形成離子結構，極性增強，故不易被吸附。因黃酮顯弱酸性，故在酸性和弱酸性條件下易被吸附，但試驗發(fā)現(xiàn)pH繼續(xù)降低時黃酮粗品溶解度降低，可能是因為pH繼續(xù)降低，達到排草黃酮的等電點，上樣液不穩(wěn)定，所以上樣液pH為4時吸附效果最好。由圖3中(b)可知，洗脫液乙醇濃度為80%時，解吸下來的排草黃酮量最多，因此使用80%的乙醇溶液作為最佳的洗脫液。

圖3 上樣液pH值及洗脫液乙醇溶液濃度對純化效果的影響Fig.3 Effect of pH of loading buffer and ethanol solution of eluent on purification effect

2.5.2 上樣流速及洗脫流速的確定

由圖4中(a)可知，當上樣流速為2 BV/h時，泄漏點出現(xiàn)的較早，此時排草黃酮由于流速過快而未被充分吸附到柱子上；當上樣流速為1.5 BV/h和1 BV/h時泄漏點出現(xiàn)的時間差不多，上樣體積均大于2 BV/h時，且1.5 BV/h的上樣量比1 BV/h時略大。因此，最終選擇最佳上樣流速為1.5 BV/h。由圖4中(b)可知，當洗脫流速為1.5 BV/h時，排草黃酮的洗脫效果最佳。當洗脫流速增加時，乙醇會以略快的流速流經(jīng)大孔吸附樹脂，不能充分滲入樹脂內(nèi)部，無法將樹脂內(nèi)的排草黃酮全部解吸出來，從而致使洗脫效果下降。而當洗脫流速過慢時，乙醇會在大孔樹脂中停留過久，使黃酮的峰寬較大，時間更長，洗脫效果不好，因此選擇最佳洗脫流速為1.5 BV/h。

圖4 上樣流速及洗脫流速對純化效果的影響Fig.4 Effect of flow rate of loading buffer and eluent on purification effect

2.6 排草黃酮抗氧化活性的研究

按照1.2.5中的方法測定排草黃酮及Vc清除DPPH自由基的曲線，得到排草黃酮清除率回歸方程為Y=-0.01X2+1.9609X-7.9433(R2=0.9965)。經(jīng)計算排草黃酮對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為36.25 μg/mL。Vc清除率回歸方程為Y=-0.0119X2+2.1058X+0.2917(R2=0.9665)，經(jīng)計算，Vc對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為28.05 μg/mL。綜上所述，排草黃酮的抗氧化活性與Vc比較稍差，但仍然具有較強的抗氧化活性。

3 結論

超聲波輔助法提取排草黃酮的最佳條件為：提取時間80 min，提取溫度50 ℃，乙醇濃度50%，料液比1∶40，在最佳提取工藝條件下排草黃酮的得率為3.16%；最佳純化條件為：選取HPD-100型號的大孔樹脂，上樣液pH為4，上樣流速為1.5 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為80%，洗脫流速為1.5 BV/h，經(jīng)純化后排草黃酮的純度由原來的24.8%提高到68.1%，純化效果較好；排草黃酮對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50值為36.25 μg/mL，與Vc比較稍差，但仍然表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，是一種可開發(fā)的高效、天然的抗氧化劑。