張鵬斐

(湖南省懷化市食品藥品檢驗所，湖南 懷化 418000)

植物固體飲料是以植物及其提取物為主要原料加工制成的一類沖泡型飲料，近些年被作為代餐減肥食品受到了很多人青睞，然而其安全隱患也隨之而來。從20世紀90年代“植物毒素”[1-2]這一名稱的提出到最近幾年關于植物類食品安全隱患的研究報道[3-5]，均表明相關學者對植物類食品的安全性提出了質(zhì)疑。并且，歐盟、澳大利亞和新西蘭等國家和地區(qū)對飲料中10種植物毒素(蘆薈苷、β-細辛腦、黃連素、黃樟素和異黃樟素、山道年、原百部堿、長葉薄荷酮、側(cè)柏酮、香豆素)的含量進行了嚴苛規(guī)定[6]，并以此管控中國出口產(chǎn)品，而中國相關標準與法規(guī)還相對缺乏[7]。

目前，植物毒素的樣品處理方法僅有傳統(tǒng)的固相萃取法[8-9]，且均用于液體飲料中，并不適用于固體飲料，而且用該方法處理樣品后提取液渾濁不清不適用于檢測。相較于上述方法，QuEChERS法操作簡單、吸附性高、效率高、提取液澄清[10-12]，更適用于成分復雜的植物固體飲料成分提取。關于植物毒素的檢測方法主要有氣相色譜法[13]、氣相色譜—質(zhì)譜法[14-15]、液相色譜法[16-17]及液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[18]等，其中，高效液相色譜法為主要方法，對于復雜組分分析有明顯優(yōu)勢，且DAD檢測器能通過DAD圖譜比對判斷檢測成分是否為所測成分。綜上考慮，試驗擬采用QuEChERS方法對市售的植物固體飲料進行提取、凈化，用超高效液相色譜DAD定性定量，以建立同時檢測植物固體飲料中10種植物毒素的方法，以期為植物固體飲料的日常監(jiān)督提供有利且客觀的技術依據(jù)。

1 試驗方法

1.1 儀器與設備

高效液相色譜儀：e2695型，沃特世科技(上海)有限公司；

高速冷凍離心機：ST 16R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

電子天平：AE2204型，湘儀天平儀器設備有限公司；

超聲清洗機：Model 9960B型，天津科貝爾光電技術有限責任公司；

可調(diào)式混勻儀：MX-S型，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司；

超純水儀：Synergy High flow型，默克化工技術(上海)有限公司。

1.2 試劑與材料

原百部堿(CAS：27495-40-5)：純度99.67%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

香豆素(CAS：91-64-5)：純度100%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

黃連素(CAS：633-65-8)：純度97.15%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

山道年(CAS：481-06-1)：純度99.80%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

蘆薈苷(CAS：1415-73-2)：純度99.11%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

側(cè)柏酮(CAS：1125-12-8)：純度98.4%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

β-細辛腦(CAS：5273-86-9)：純度98.06%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

長葉薄荷酮(CAS：89-82-7)：純度99.8%， 中國食品藥品檢定研究院；

黃樟素(CAS：94-59-7)：純度99.6%，美國Stanfordchem公司；

異黃樟素(CAS：120-58-1)：純度97.0%，美國AccuStandard公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國GRACE公司；

乙酸銨：色譜純，美國ACS公司；

甲酸：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；

氯化鈉、無水硫酸鎂、醋酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)：40～60 μm，武漢市偉琪博星生物科技有限公司；

石墨化碳黑(GCB)：40～120 μm，武漢市偉琪博星生物科技有限公司；

分析樣品(10種植物固體飲料)：市售。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 植物毒素標準儲備液的配制 將10種植物毒素分別用甲醇配制成約1.0 g/L的標準濃度的儲備溶液，將其放置在4 ℃的冰箱里避光冷藏，可儲存6個月。

1.3.2 植物毒素混合標準溶液的配制 分別吸取上述適量的10種植物毒素的單標儲備液，用30%甲醇—70% 10 mmol/L乙酸銨溶液(pH 3.5)稀釋成濃度約為200 mg/L的混合標準溶液。測試時，用30%甲醇—70% 10 mmol/L乙酸銨溶液(pH 3.5)將混合標逐步稀釋成用于檢測靈敏度和線性范圍分析配制的標準工作溶液。

1.4 色譜條件的探索

之前有研究者[8]發(fā)現(xiàn)有些植物毒素更具堿性和極性。進行HPLC檢測時，容易出現(xiàn)色譜峰形狀不佳，拖尾和分離度不足等情況，參考已有液體飲料中7種植物毒素的液相色譜測定方法[9]進行優(yōu)化，固定甲醇為流動相的一種，考察水、乙酸銨緩沖液、甲酸溶液等不同流動相比例，以出峰時間、峰形及峰分離度為指標考察流動相比例。同時，液相色譜柱的填充物對混合標液分離效果也有較大的影響，對比了Wlech Xtimate C8和Waters WAT054275 C18色譜柱的效果，對液相色譜的參數(shù)、室內(nèi)溫度等進行調(diào)整，讓液相色譜儀處于最佳狀態(tài)，從而得到了較好的分離效果。

1.5 樣品提取凈化QuEChERS方法設計

1.5.1 樣品提取 參考QuEChERS法用于涼茶中[19]的前處理技術，通過對比振蕩提取、超聲提取的加標回收率，選擇合適的提取方式。

在提取階段QuEChERS方法通常加入過飽和的無水硫酸鎂，加快有機相與水相分層，且提高樣品回收率。因此試驗先考察加入單一除水劑無水硫酸鎂的回收率，確定其最佳加入量，再比較在確定加入無水硫酸鎂的基礎上加入氯化鈉和醋酸鈉的加標回收率，確定用一種除水劑或多種除水劑。通過固定一種鹽的量，變化另一種鹽的量，根據(jù)回收率結(jié)果，對除水劑的用量比例進行優(yōu)化，從而得到較好的除水劑比例。

1.5.2 樣品凈化 QuEChERS方法中，PSA、C18和GCB是常見的3種吸附劑。PSA能夠清除樣品共萃取物中的脂肪酸、某些色素和糖類等極性基質(zhì)成分，而對生物堿無吸附作用[12]。因此試驗先考察僅加入PSA 吸附劑的凈化效果，再在確定加入PSA的基礎上，考察加入C18和GCB吸附劑時的加標回收率，且對比使用不同質(zhì)量的PSA，從而得到理想的凈化條件。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

摸索不同濃度的混合標準溶液在液相色譜中得到的響應值，將橫軸變量設定為植物毒素濃度，并將峰面積設定為縱軸變量，從而得到標準曲線及其線性關系?；跇藴是€，通過外標方法計算加標樣品中各種植物毒素的回收率，并獲得購買樣品中的植物毒素含量。通過陰性樣品的加標回收率試驗得到不同加標濃度下的回收率和精密度，采用控制變量法篩選出較優(yōu)試驗條件。

為驗證方法的可靠性，采用加標回收法，在陰性植物固體飲料樣品中，分別添加高、中、低3個質(zhì)量濃度水平的10種植物毒素混合標準溶液，測量每個濃度水平6次以獲得回收率和相對標準偏差。連續(xù)測試相應濃度的加標溶液5 d，并測量日間的精度。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相條件的優(yōu)化 通過對比不同流動相及各種pH的流動相，發(fā)現(xiàn)對于這類堿性較強、極性較大的植物毒素在酸性較大的乙酸銨緩沖鹽流動相中能有較好的分離度，當流動相pH值為3.5時能得到較好的峰狀態(tài)，并當pH值低于3.5時，峰形及峰分離度等變化不大，考慮到液相色譜柱的耐酸性，最終確定以pH為3.5的乙酸銨緩沖液和甲醇作為流動相進行梯度洗脫。

2.1.2 液相色譜柱的選擇 對比了Wlech Xtimate C8和Waters WAT054275 C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)色譜柱Wlech Xtimate C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)有更好的分離度。

2.1.3 最佳液相色譜條件的確定 將10種植物毒素混合標準溶液用Wlech Xtimate C8色譜柱，以pH為3.5的乙酸銨緩沖液和甲醇作為流動相進行液相色譜檢測，調(diào)節(jié)流動相比例，通過液相色譜DAD檢測器全波段掃描，得到了全波段掃描圖，通過篩選分別在260，290，355 nm處得到了較好的標準品色譜圖，如圖1所示。

圖1 10種植物毒素化合物的高效液相色譜圖

最終確定最佳的色譜條件：色譜柱為Wlech Xtimate C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液(pH 3.5)，流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～15 min，70% A；15～20 min，70%～60% A；20～35 min，60%～45% A；35～36 min，45%～35% A；36～50 min，35% A；50～51 min，35%～70% A；51～55 min，70% A。流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；后運行時間5 min；檢測波長260，290，355 nm；進樣量10 μL。

2.2 樣品處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取條件 通過對比振蕩提取、超聲提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取操作簡單，且比振蕩提取有更高的提取率。乙腈極性較強，與水互溶，加入鹽后容易與水分離，與丙酮和乙酸乙酯相比，乙腈不易提取色素和基質(zhì)中的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分，因此選擇乙腈作為提取液。

當僅用無水硫酸鎂作除水劑時，加入約50 μg/L混標，隨著無水硫酸鎂用量的增加，能較好地除去樣品中的水分，其加標回收率也逐漸增大。如圖2所示，當無水硫酸鎂用量>2 g時，過多的無水硫酸鎂吸收水分后會吸收其他有效成分，導致回收率有所降低，因此無水硫酸鎂用量為2 g時較理想。

圖2 無水硫酸鎂用量對10種植物毒素回收率的影響

在確定加入無水硫酸鎂的基礎上比較加入氯化鈉和醋酸鈉的效果，發(fā)現(xiàn)加入氯化鈉的回收率較高。因而氯化鈉在該方法中吸水效果較好，通過試驗，固定無水硫酸鎂的量為2 g，變化氯化鈉的量，對無水硫酸鎂和氯化鈉的用量比例進行優(yōu)化，結(jié)果(圖3)表明：當氯化鈉的質(zhì)量為2 g時，回收率水平最為理想，表明在無水硫酸鎂與氯化鈉以1∶1混合時，前處理所加水分被較好除去且不損失其他成分。

圖3 除水劑組成比例對10種植物毒素回收率的影響

2.2.2 凈化條件 對比3種吸附劑PSA、C18和GCB的吸附效果，發(fā)現(xiàn)用多種吸附劑的回收率均不如僅用PSA的，隨著PSA中加入C18和GCB比例的增加混標回收率呈下降趨勢(見圖4)，印證了PSA不僅能夠清除脂肪酸、色素和糖類等成分，對生物堿無吸附作用，有較高的保留該混合溶液中植物毒素的效果。對PSA的添加量進行對比，得知用400 mg PSA作為吸附劑回收率最高，見圖5。在QuEChERS方法中雖然較多的吸附劑能有較好的吸附效果，但并不是吸附劑添加越多越好，隨著吸附劑的增加上清液越來越澄清，但吸附劑添加至一定量時會出現(xiàn)飽和狀態(tài)，回收率不再隨著吸附劑的增加而增加，甚至回收率會有所降低。

圖4 吸附劑比例對10種植物毒素回收率的影響

圖5 吸附劑PSA含量對10種植物毒素回收率的影響

最終確定樣品前處理方法：稱取5.000 g固體飲料置于50 mL具塞離心管中，加10 mL水和15 mL乙腈超聲15 min。加入2 g無水MgSO4，2 g NaCl，渦旋混勻2 min，于8 000 r /min離心5 min。準確吸取上清液5 mL置于已加入400 mg PSA的50 mL離心管中，混勻，8 000 r/min離心10 min。準確吸取上清液過0.45 μm有機濾膜于樣品瓶中，供液相色譜分析測定。

2.3 標準曲線、線性關系與檢出限定量限

由表1可知，10種植物毒素在固定的濃度范圍內(nèi)其相關系數(shù)均大于0.997，表示其均有較好的線性關系，適用于固體飲料中10種植物毒素的定量檢測，由于標準品均為固體配置而成，因而線性范圍并非整數(shù)。在陰性固體飲料樣品中添加不同濃度的待測物，按照試驗建立的方法進行測定，得出10種植物毒素的檢出限(S/N=3)為0.010～0.270 mg/kg，定量限(S/N=10)為0.032～0.830 mg/kg，說明該方法檢測濃度較低，具有較好的靈敏度，能夠滿足日常檢測檢驗。

表1 10種植物毒素化合物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 方法的準確度和精密度

由表2可知，加標回收率最低77.2%，最高105.2%，且RSD值為1.02%～2.96%，濃度較低的回收率較低，濃度高的回收率較高，添加較低濃度水平的加標樣在處理過程中損失的可能性更大。這些加標樣回收率的RSD值變化幅度并不大，表示該方法穩(wěn)定性好，側(cè)柏酮的響應值是所有待測物中最低的，在檢測的過程中會有少許波動，因此其回收率RSD值變化稍大一些。

表2 回收率與精密度的結(jié)果

試驗范圍內(nèi)10種植物毒素化合物的日間精密度為1.21%～2.85%，且波動范圍均不大，表明該儀器穩(wěn)定性好，精密度高。得到的數(shù)據(jù)均能達到GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的要求，能夠滿足日常檢測需要。

2.5 實際樣品的測定

用試驗建立的前處理方法處理10種市售植物固體飲料，并通過建立的液相色譜方法對所有樣品進行DAD掃描，發(fā)現(xiàn)其中有一個混合類代餐固體飲料中含有香豆素，其濃度為0.04 μg/L，結(jié)合樣品處理過程，得到其含量為0.20 mg/kg，盡管該結(jié)果低于《歐盟食品中化學污染物限量規(guī)定》對于植物性的飲料里植物毒素香豆素≤2 mg/kg的限量規(guī)定，但表明目前市售的植物固體飲料存在潛在的風險。

3 結(jié)論

將QuEChERS樣品處理方法用于植物固體飲料中植物毒素原百部堿、側(cè)柏酮、香豆素、黃連素、黃樟素、山道年、蘆薈苷、細辛腦、異黃樟素、長葉薄荷酮的測定，通過對QuEChERS處理方法以及液相色譜條件的優(yōu)化，建立了定性、定量檢測植物固體飲料中10種植物毒素的檢測方法。選擇乙腈提取樣品中的植物毒素，應用QuEChERS技術凈化，采用配備PDA檢測器的高效液相色譜儀進行分離測定，外標法定量。該處理方法簡單，純化效果好，檢測靈敏度高，對固體飲料凈化效果較好，可用于植物固體飲料中10種植物毒素的定性和定量分析。樣品處理結(jié)果表明，除微量香豆素外，其他植物毒素并未檢出。表明植物毒素對食用者身體健康影響的潛在風險是存在的，因此建議將植物毒素的檢測納入固體飲料質(zhì)量控制范疇，促進其不斷規(guī)范和提高，從而提高固體飲料整體質(zhì)量水平。