張婷婷 馮穎杰 楊宗燦 文秋成 王高杰 馬勝濤 李懷奇 張 展

(河南中煙煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000)

中國(guó)每年煙葉產(chǎn)量 450萬～500萬t，且在煙草種植和加工過程中產(chǎn)生的低次煙葉、莖稈、杈煙等煙草廢棄物可達(dá)煙葉總產(chǎn)量的25%[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)廢、次煙葉產(chǎn)品的綜合利用主要是從中提取茄尼醇、煙堿和蛋白質(zhì)等，也有用于制作有機(jī)肥料及雞飼料，但其大部分被作為廢物丟棄或焚燒，造成了自然資源的浪費(fèi)和極大的環(huán)境污染[2]。

細(xì)菌纖維素(BC)具有與植物纖維素相似的化學(xué)成分，卻具有更高的純度、持水性、聚合度、結(jié)晶度，以及更良好的生物相容性和更高機(jī)械強(qiáng)度[3]?；讵?dú)特的優(yōu)良性質(zhì)，細(xì)菌纖維素作為一種新型納米生物材料受到科學(xué)和工業(yè)界的廣泛關(guān)注，并在食品工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)器材、紡織等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛研究和應(yīng)用[4-5]。

細(xì)菌纖維素生產(chǎn)中，培養(yǎng)基原料的成本偏高尤其是碳源的成本偏高，制約了細(xì)菌纖維素的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化進(jìn)程。近年來，各種工業(yè)副產(chǎn)品和農(nóng)林業(yè)廢物已被用作碳源以提高產(chǎn)量和減少BC生產(chǎn)的成本。截至目前，已有幾種原料廢料被證實(shí)是BC生產(chǎn)的潛在基質(zhì)，如果汁、玉米秸稈、飲料工業(yè)廢棄物、玉米芯酸水解物和廢啤酒酵母[5-7]。煙草中富含糖、氨基酸、無機(jī)鹽等組分，可作為發(fā)酵底物，但利用煙草廢料發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素尚未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬研究利用煙草廢料提取液發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的可行性，探索煙草廢料利用，旨在為BC生物材料生產(chǎn)提供有效碳源，同時(shí)為拓展煙草廢棄物的綜合利用提供一條全新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

廢棄煙末：收集自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司卷煙廠除塵車間；

發(fā)酵菌種：木醋桿菌，實(shí)驗(yàn)室保藏；

酵母粉、蛋白胨：美國(guó)OXOID公司；

淀粉酶：4 000 U/g，無錫杰能科生物工程有限公司；

葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸、氫氧化鈉：分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：Forma3913型，賽默飛世爾科技公司；

連續(xù)流動(dòng)分析儀：AutoAnalyzer3型，德國(guó)Seal公司；

射線衍射儀：XRD-6100型，日本島津制作所；

傅立葉變換紅外光譜儀：VERTEX70型，德國(guó)布魯克儀器公司；

透射電鏡：JEM-1011型，日本電子株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 煙末浸提液及HS培養(yǎng)基制備

(1) HS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氫二鈉4 g/L、一水合檸檬酸1.2 g/L，120 ℃滅菌10 min。

(2) 煙末浸提液培養(yǎng)基：煙末100 g/L，在70 ℃條件下浸提100 min后過濾，保留濾液，120 ℃滅菌10 min。

(3) 煙末浸提液酶解處理培養(yǎng)基：煙末100 g/L，淀粉酶200 U/mL，在50 ℃條件下浸提100 min后過濾，保留濾液，120 ℃滅菌10 min。

(4) 煙末浸提液酸解處理培養(yǎng)基：煙末100 g/L，硫酸1 mol/L，在70 ℃條件下浸提100 min后過濾，保留濾液，120 ℃滅菌10 min。

1.2.2 煙末浸提液常規(guī)組分測(cè)定 取2 mL浸提液，加入1 mL乙酸和17 mL蒸餾水，100 r/min震蕩40 min，過濾后進(jìn)行分析。

(1) 水溶性糖：按YC/T 159—2002執(zhí)行。

(2) 總氮(不包括硝態(tài)氮)：按YC/T 161—2002執(zhí)行。

(3) 總植物堿(以煙堿計(jì))：按YC/T 160—2002執(zhí)行。

(4) 氯：按YC/T 162—2002執(zhí)行。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化 從菌種斜面上，用接種環(huán)挑取菌落，接種至HS液體培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫條件下，以120 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，得到種子液。利用煙末浸提液作為培養(yǎng)基，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

(1) 發(fā)酵溫度：在初始pH值5，接種4%，發(fā)酵時(shí)間7 d的條件下，考察發(fā)酵溫度(20，25，30，35，40 ℃)對(duì)細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

(2) 發(fā)酵時(shí)間：在初始pH值5，接種4%，發(fā)酵溫度30 ℃條件下，考察發(fā)酵時(shí)間(4，7，8，9，10 d)對(duì)細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

(3) 接種量：在初始pH值5，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d的條件下，考察接種量(4%，6%，8%，10%，15%)對(duì)細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

(4) pH值：在接種4%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間 7 d 的條件下，考察發(fā)酵初始pH值(4.5，5.0，5.5，6.0，6.5)對(duì)細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

1.2.4 細(xì)菌纖維素物理表征

(1) 掃描電鏡觀察：冷凍干燥后的BC膜粘于導(dǎo)電膠上，置于真空鍍膜機(jī)中進(jìn)行表面噴金1 min，放入掃描電鏡中觀察并拍照，觀察電壓為5 kV。

(2) 紅外光譜分析：采用KBr 壓片進(jìn)行紅外光譜表征，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

(3) X射線衍射分析：Cu靶，40 kV高壓，管流為40 mA，2θ為 10°～80°掃描，得到 XRD光譜，采用Jade軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.2.5 BC產(chǎn)量和持水性計(jì)算 根據(jù)文獻(xiàn)[8]修改如下：將發(fā)酵獲得的BC膜撈出，用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡，沸水浴中煮1 h，然后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性。將洗滌后經(jīng)4 000 r/min離心20 min的細(xì)菌纖維素膜定義為濕膜，將105 ℃下烘干至恒重的細(xì)菌纖維素膜定義為干膜，將干膜于常溫水中浸泡48 h后用濾紙吸干表面水分，所得膜定義為復(fù)水膜。分別按(1)～(3)計(jì)算BC的產(chǎn)量、含水率和復(fù)水率。

(1)

(2)

(3)

式中：

R——細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，g/L；

c1——濕膜含水率，%；

c2——干膜復(fù)水率，%；

V——發(fā)酵液體積，L；

Mw——濕膜的質(zhì)量，g；

Md——干膜的質(zhì)量，g；

Mwr——復(fù)水膜的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同煙末浸提處理方法比較

如圖1所示，直接采用水提處理的煙末浸提液培養(yǎng)基時(shí)，BC可以有效生長(zhǎng)，產(chǎn)量約達(dá)1.6 g/L。采用淀粉酶酶解處理煙末制得的浸提液培養(yǎng)中還原糖和總糖濃度略有增加，BC產(chǎn)量也提高至1.7 g/L。采用稀硫酸水解煙末制備的浸提液培養(yǎng)基中糖濃度最高，但是BC的生長(zhǎng)完全被抑制。這可能是由于浸提液的pH偏低，不利于微生物的生長(zhǎng)。但采用NaOH將浸提液pH調(diào)節(jié)至5左右時(shí)，BC產(chǎn)量?jī)H為1.0 g/L。文獻(xiàn)[9]報(bào)道，酸解過程中可能會(huì)增加糠醛類等抑制微生物活性的組分，從而給BC的生長(zhǎng)帶來不利影響?？傮w比較認(rèn)為，酶處理或酸解處理流程更復(fù)雜，成本更高，且對(duì)BC產(chǎn)量沒有顯著的促進(jìn)作用。因此，煙末直接水提作為BC生產(chǎn)的培養(yǎng)基是最佳選擇。

圖1 不同煙末浸提法細(xì)菌纖維素產(chǎn)量

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

采用煙末直接水提的浸提液做培養(yǎng)基，考察了接種量、溫度、pH、發(fā)酵時(shí)間等條件對(duì)BC產(chǎn)量的影響，如圖2所示。由圖2可知：

圖2 BC發(fā)酵條件優(yōu)化

(1) 發(fā)酵溫度由20 ℃升高至30 ℃時(shí)，BC產(chǎn)量顯著提高。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至35 ℃時(shí)，BC產(chǎn)量下降，在40 ℃菌體幾乎沒有細(xì)菌纖維素的生成，微生物的生長(zhǎng)需要依靠酶將蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)進(jìn)行分解而后被細(xì)胞利用，當(dāng)溫度過低或過高時(shí)都會(huì)影響酶的活性，造成細(xì)菌纖維素產(chǎn)量下降，結(jié)果表明30 ℃最適合菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物生成，是最佳發(fā)酵溫度。

(2) BC產(chǎn)量在0～7 d內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增長(zhǎng)，7～10 d BC產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢。這可能由于發(fā)酵初期碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)充足，菌體生長(zhǎng)較快，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，碳源、氮源等大量消耗且葡萄糖酸、乙酸等代謝副產(chǎn)物積累，發(fā)酵液的pH下降，抑制了BC的合成。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間以7 d為宜。

(3) 隨著接種量的增加，BC產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)接種量超過6%后，BC產(chǎn)量增加幅度趨緩。提高接種量或許可以縮短延遲期，加快菌體生長(zhǎng)，使產(chǎn)物形成期提前，但是如果接種量過多，也會(huì)導(dǎo)致底物前期消耗過快，不利于后期產(chǎn)物積累。而且在接種量較高的情況下，由于菌體濃度過大，可能導(dǎo)致代謝產(chǎn)酸過多，發(fā)酵液中的溶氧減少，反而影響B(tài)C的合成[10]。因此，最佳接種量選定為6%。

(4) 初始pH值為5時(shí)BC產(chǎn)量最高，當(dāng)pH過高或過低時(shí)，BC產(chǎn)量都會(huì)下降，因此最佳發(fā)酵初始pH值為5。

綜上所述，利用煙末廢料水提液作為培養(yǎng)基，利用木醋桿菌進(jìn)行發(fā)酵，最優(yōu)發(fā)酵條件為接種量6%，初始pH 5，溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d。

2.3 重復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證

為了驗(yàn)證菌株對(duì)原料的適應(yīng)性和發(fā)酵穩(wěn)定性，選取不同批次的廢棄煙末開展了重復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[11]，在煙末與水比例1∶10 (g/mL)，溫度70 ℃條件下，對(duì)煙末水提60 min，煙末提取液常規(guī)組分如表1所示，提取液中還原糖、總糖、總氮等各項(xiàng)組分濃度高低與煙末原料表現(xiàn)一致，F(xiàn)號(hào)煙末提取液總糖和還原糖含量最高(分別為18.15，16.28 mg/mL)，A號(hào)煙末提取液總糖和還原糖含量最低(分別為9.46，8.72 mg/mL)，6種煙末總堿、總氮、氯等組分則含量較為接近。

按照2.2優(yōu)化的工藝條件，以6種煙末提取液為培養(yǎng)基在30 ℃條件下、接種6%、發(fā)酵7 d，以HS培養(yǎng)基為對(duì)照，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量如圖3所示，BC產(chǎn)量為1.8～2.5 g/L。從圖3可以看出，6種煙末糖濃度高低與發(fā)酵產(chǎn)生的BC產(chǎn)量表現(xiàn)一致，F(xiàn)號(hào)煙末提取液發(fā)酵的BC產(chǎn)量最高，接近HS培養(yǎng)基BC產(chǎn)量，說明煙末提取液能夠滿足菌體生長(zhǎng)，是發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的良好底物。

表1 6種煙末提取液常規(guī)組分

圖3 煙末水提取液糖濃度與細(xì)菌纖維素產(chǎn)量關(guān)系

2.4 細(xì)菌纖維素表征

由圖4可知，以煙末提取液作為培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素?fù)碛忻芗慕豢棾?xì)纖維網(wǎng)絡(luò)，其直徑遠(yuǎn)小于天然纖維素，與前人[12]研究的使用其他原始廢料產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的觀察結(jié)果相似。與HS培養(yǎng)基相比，煙末培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素有密度較大的網(wǎng)絡(luò)和較小的原纖維寬度，以及更為光滑的纖維表面。

圖4 細(xì)菌纖維素掃描電鏡圖

圖5 細(xì)菌纖維素XRD圖

如圖6所示，來自HS培養(yǎng)基、煙末提取液的細(xì)菌纖維素樣品同購(gòu)買所得樣品一樣具有纖維素的特征峰。區(qū)分峰值3 340 cm-1表示O—H拉伸，2 900 cm-1表示C—H伸縮，1 645 cm-1表示C—O—C拉伸，1 064 cm-1表示C—O拉伸和900 cm-1表示平面內(nèi)的γ(COC)，對(duì)稱拉伸，Jahan等[14]已經(jīng)報(bào)道了類似的研究結(jié)果。從HS培養(yǎng)基和煙末提取液獲得的細(xì)菌纖維素未見明顯區(qū)別，表明培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)BC功能團(tuán)沒有影響。

圖6 細(xì)菌纖維素紅外光譜圖

如表2所示，從煙草提取液中獲得的細(xì)菌纖維素膜含水率為97.9%，略低于HS培養(yǎng)基中的細(xì)菌纖維素膜，兩種細(xì)菌纖維素膜的復(fù)水率相似，分別為67.5%，67.9%，兩種培養(yǎng)基中獲得的膜持水性相似。

表2 細(xì)菌纖維素含水率和復(fù)水率

綜上所述，煙末發(fā)酵制備的BC與對(duì)照樣品(HS培養(yǎng)基)相比，在形貌結(jié)構(gòu)，物理性能上均無顯著差異。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，煙末水浸提液可直接作為發(fā)酵原料生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，無需額外添加碳源氮源；以煙末水浸提液為原料，發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的最優(yōu)工藝為接種量6%，初始pH為5，溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d；不同批次的廢棄煙末發(fā)酵驗(yàn)證表明，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨原料中糖含量的增加而增加，產(chǎn)量在1.8～2.5 g/L，與HS培養(yǎng)基相當(dāng)；煙末發(fā)酵制備的細(xì)菌纖維素與對(duì)照樣品(HS培養(yǎng)基)相比，在形貌結(jié)構(gòu)上無顯著差異。綜上所述，利用煙草廢棄物發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素具有可行性。