陳星星,張斌斌,郭紹雷,,馬瑞娟,姜衛(wèi)兵*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的、基因程序化的過(guò)程,涉及多種生物代謝途徑,可影響果實(shí)的顏色、質(zhì)地、風(fēng)味,并調(diào)控果實(shí)軟化[1-2]。桃(Prunuspersica)屬于典型的呼吸躍變型果實(shí),在果實(shí)成熟過(guò)程中果實(shí)質(zhì)地發(fā)生變化,硬度下降,呼吸強(qiáng)度迅速升高,伴隨著乙烯的大量釋放[3],相關(guān)基因的表達(dá)水平上調(diào),果實(shí)發(fā)育迅速進(jìn)入成熟階段。

研究表明,桃果實(shí)的成熟過(guò)程與乙烯的產(chǎn)生密切相關(guān),其成熟與衰老較難控制,貯藏期較短,屬易腐爛果實(shí)類型[4-7]。乙烯釋放量的變化與其生物合成途徑的關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶(ACS)和1-氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶(ACO)活性有關(guān)[8-9],與乙烯合成相關(guān)的基因表達(dá)變化對(duì)果實(shí)顏色、風(fēng)味、質(zhì)地等特征的變化都有影響,進(jìn)而決定果實(shí)的綜合品質(zhì)[10]。Mathooko等[11]指出PpACS1和PpACO1基因的表達(dá)在桃果實(shí)成熟期對(duì)乙烯生物合成的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。在乙烯生物合成過(guò)程中,由多基因家族編碼的ACS和ACO表達(dá)水平受發(fā)育進(jìn)程和環(huán)境因素的綜合影響。有研究表明,不同成熟度的桃果實(shí)軟化過(guò)程中乙烯合成相關(guān)基因編碼種類和表達(dá)水平存在差異[12-13]。軟溶質(zhì)型桃‘雨花3號(hào)’果實(shí)在成熟度Ⅰ到成熟度Ⅴ過(guò)程中,ACS和ACO活性變化趨勢(shì)與乙烯相似,且伴隨乙烯的生成,其基因表達(dá)量逐漸增加;而硬溶質(zhì)型桃‘加納巖’在成熟過(guò)程中,ACS表達(dá)趨勢(shì)相對(duì)平緩,ACO活性一直較低,其基因的表達(dá)在成熟前期幾乎檢測(cè)不到,成熟度Ⅲ時(shí)開(kāi)始有較弱的表達(dá),之后表達(dá)量緩慢上升[12]。

本研究以4種不同肉質(zhì)類型的桃果實(shí)為材料,采用氣相色譜技術(shù)研究3個(gè)成熟度桃果實(shí)乙烯釋放的規(guī)律,并對(duì)乙烯生物合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)合果實(shí)硬度和呼吸速率的變化,以期明確桃果實(shí)成熟過(guò)程中呼吸和乙烯的變化規(guī)律與成熟度的關(guān)系,闡明導(dǎo)致成熟度差異的內(nèi)在因素,進(jìn)而為深入研究果實(shí)軟化機(jī)制及準(zhǔn)確判斷成熟度、適時(shí)采收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試材料為4種肉質(zhì)類型的12個(gè)桃品種(表1),果實(shí)均采自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)南京桃資源圃。樹(shù)體健壯,樹(shù)形為三主枝自然開(kāi)心形,每個(gè)品種3株,常規(guī)栽培措施管理。

表1 不同肉質(zhì)桃3個(gè)成熟度果實(shí)的取樣日期Table 1 The sampling dates of fruits with three maturity degrees of different fleshy peaches

于2018年按各品種的成熟期(表1)采收樹(shù)冠中部以上外圍光照條件良好的果實(shí),采后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,根據(jù)不同的成熟度(七成熟:果實(shí)底色為綠色,已充分發(fā)育,但茸毛厚、多;八成熟:底色變淡,發(fā)白或黃,果面豐滿,毛茸稍稀,果實(shí)仍較硬;九成熟:果皮呈乳白色或淺黃色,彈性增大,有芳香氣味,果面著色充分)隨機(jī)選留大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)各15個(gè),每5個(gè)果實(shí)為1個(gè)重復(fù),進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)試驗(yàn)測(cè)定。桃果實(shí)去皮后切碎,放入液氮速凍,置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)呼吸速率的測(cè)定采用氣體分析儀(PBI Dansensor,丹麥)測(cè)定果實(shí)呼吸速率,以25 ℃下單位質(zhì)量的桃果實(shí)在單位時(shí)間內(nèi)CO2的釋放量表示果實(shí)的呼吸速率。將果實(shí)稱量并記錄其質(zhì)量(m),在25 ℃條件下置于4.5 L的密閉容器中1 h,連接儀器測(cè)量CO2含量(C),最后用改進(jìn)排水法[13]測(cè)定每組果實(shí)的體積(V)。呼吸速率計(jì)算公式為:

呼吸速率(mg·kg-1·h-1)=103×(4.5-V)×C× 1.96/m。

式中:V為果實(shí)體積(L);C為CO2體積分?jǐn)?shù)(%);1.96為CO2密度(mg·mL-1);m為桃果實(shí)質(zhì)量(kg)。

1.2.2 果實(shí)乙烯釋放速率與硬度的測(cè)定將果實(shí)置于密閉容器中,2 h后抽取氣體測(cè)定乙烯釋放量。以單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量果實(shí)的乙烯釋放量表示桃果實(shí)的乙烯釋放速率。乙烯測(cè)定所用儀器為GC-7890A型氣相色譜儀(Agilent),色譜條件:FID檢測(cè)器,Hp-Plot q 毛細(xì)管柱(20 m×0.53 mm×20 μm),分流比10,載He,柱溫40 ℃,檢測(cè)器溫度220 ℃,進(jìn)樣量1 mL。以鮮果測(cè)定,重復(fù)3次。

在桃果實(shí)縫合線對(duì)側(cè)中部用TA.XT.Plus型質(zhì)構(gòu)儀(探頭直徑8 mm,測(cè)試深度5 mm,貫入速率1 mm·s-1)測(cè)定果實(shí)的去皮硬度(果肉硬度)。取2個(gè)點(diǎn)的平均值作為每個(gè)果實(shí)的去皮硬度。

1.2.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取樣品總RNA,通過(guò)PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成第1鏈cDNA作為RT-qPCR模板。

1.2.4 相關(guān)基因表達(dá)分析根據(jù)桃已登錄序列采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并結(jié)合前人研究[14],通過(guò)預(yù)試驗(yàn),選定5個(gè)ACS和1個(gè)ACO基因的特異性引物序列(表2),引物由TSINGKE生物公司合成。熒光染料使用SYBR Green(TaKaRa)。采用RT-qPCR技術(shù),研究乙烯生物合成相關(guān)基因在不同肉質(zhì)類型3個(gè)成熟度桃果實(shí)上的表達(dá)特性,以桃TEF2(PpTEF2)為內(nèi)參基因,用ABI7500的實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行熒光定量分析。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),擴(kuò)增體系(20 μL):2 μL cDNA,上、下游引物各0.8 μL,10 μL反應(yīng)MIX,0.4 μL ROX Reference DyeⅡ,6 μL ddH2O。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,共40個(gè)循環(huán)。3次重復(fù)。

表2 RT-qPCR所用引物序列Table 2 Sequences of the primers used for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel 2013和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析,基因相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCT法[15]計(jì)算,差異顯著性分析用鄧肯氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同肉質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中呼吸速率的變化

由圖1可見(jiàn):不溶質(zhì)型桃果實(shí)的呼吸速率高于其他溶質(zhì)型。軟溶質(zhì)型‘雨花露’七、八、九成熟果實(shí)呼吸速率差異不顯著,‘奉化玉露’九成熟果實(shí)的呼吸速率最高。硬溶質(zhì)型‘霞暉6號(hào)’九成熟果實(shí)呼吸速率顯著高于七、八成熟,‘湖景蜜露’七成熟果實(shí)呼吸速率顯著高于八、九成熟,‘霞暉8號(hào)’八成熟果實(shí)呼吸速率顯著高于七成熟和九成熟。不同成熟度的Stonyhard型桃果實(shí)的呼吸速率整體低于其他肉質(zhì)型,‘霞脆’和‘華玉’八成熟果實(shí)的呼吸速率低于七、九成熟,‘秦王’不同成熟度果實(shí)的呼吸速率無(wú)顯著差異。不溶質(zhì)型‘弗雷德里克’和‘金童9號(hào)’九成熟果實(shí)的呼吸速率顯著高于七、八成熟,‘金童8號(hào)’七成熟果實(shí)的呼吸速率顯著高于八、九成熟,八成熟果實(shí)的呼吸速率最低。可見(jiàn)同一肉質(zhì)不同品種桃不同成熟度果實(shí)的呼吸速率不同,但整體來(lái)說(shuō),桃果實(shí)在成熟期間呼吸速率都比較高,呼吸代謝更快。

2.2 不同肉質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中硬度的變化

隨著果實(shí)成熟度的增加,不同肉質(zhì)型桃果實(shí)硬度均呈顯著下降的趨勢(shì)(圖2)。軟溶質(zhì)型桃果實(shí)硬度隨著成熟度的增加下降幅度大且快,較其他溶質(zhì)型而言,九成熟果實(shí)硬度最低;硬溶質(zhì)型‘湖景蜜露’和‘霞暉8號(hào)’七成熟到八成熟果實(shí)硬度的下降幅度明顯高于八成熟到九成熟的;隨著成熟度的增加,Stonyhard型果實(shí)整體上保持著較高的硬度且八成熟到九成熟變化緩慢;不溶質(zhì)型果實(shí)七、八、九成熟硬度的下降幅度無(wú)顯著性差異,果實(shí)硬度隨成熟度的增加勻速下降。

2.3 不同肉質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中乙烯釋放速率的變化

如圖3所示:不同肉質(zhì)型桃在不同成熟度果實(shí)中乙烯釋放速率不同。隨著成熟度的增加,軟溶質(zhì)、硬溶質(zhì)、不溶質(zhì)型果實(shí)乙烯釋放速率逐漸升高。軟溶質(zhì)型‘雨花露’和‘奉化玉露’果實(shí)達(dá)到九成熟時(shí)乙烯釋放迅速增加,分別達(dá)到25.211和21.634 μL·kg-1·h-1;隨著果實(shí)成熟度的增加,硬溶質(zhì)型果實(shí)的乙烯釋放量明顯低于軟溶質(zhì)和不溶質(zhì)型;Stonyhard型果實(shí)乙烯釋放速率始終處于較低的水平;不溶質(zhì)型不同成熟度果實(shí)乙烯釋放速率的增加幅度較軟溶質(zhì)型低,說(shuō)明桃果實(shí)成熟時(shí)軟化速度較軟溶質(zhì)慢且成熟期較長(zhǎng)。

2.4 不同肉質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.4.1ACS家族成員的基因表達(dá)隨著桃果實(shí)成熟度的增加(從七成熟到九成熟),5個(gè)ACS基因中,PpACS1和PpACS4基因相對(duì)表達(dá)量逐漸積累且不同成熟度間差異顯著,PpACS5基因相對(duì)表達(dá)量極低,而PpACS2、PpACS3基因的表達(dá)則未檢測(cè)到。

由圖4可見(jiàn):隨著成熟度的增加PpACS1基因表達(dá)水平差異較大。軟溶質(zhì)型‘雨花露’和‘霞暉5號(hào)’果實(shí)的PpACS1基因相對(duì)表達(dá)量從大到小表現(xiàn)為九成熟、七成熟、八成熟,‘奉化玉露’八、九成熟果實(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著高于七成熟;硬溶質(zhì)型‘霞暉6號(hào)’和‘霞暉8號(hào)’果實(shí)的PpACS1基因相對(duì)表達(dá)量從大到小表現(xiàn)為八成熟、九成熟、七成熟,‘湖景蜜露’則為九成熟、八成熟、七成熟;PpACS1基因在Stonyhard型果實(shí)中表達(dá)水平極低;不溶質(zhì)型PpACS1基因的相對(duì)表達(dá)量隨果實(shí)成熟度的增加穩(wěn)定升高,且九成熟果實(shí)的PpACS1基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于七成熟和八成熟。整體來(lái)看,不同肉質(zhì)型桃九成熟果實(shí)PpACS1基因的相對(duì)表達(dá)量由大到小表現(xiàn)為:軟溶質(zhì)型、不溶質(zhì)型、硬溶質(zhì)型、Stonyhard型。

隨著桃果實(shí)成熟度的增加,PpACS4基因表達(dá)上調(diào)(圖5)。軟溶質(zhì)型3個(gè)品種基因的相對(duì)表達(dá)量由大到小依次為‘霞暉5號(hào)’‘奉化玉露’‘雨花露’,表明同一肉質(zhì)型不同桃品種PpACS4基因的相對(duì)表達(dá)量不同。硬溶質(zhì)型‘霞暉6號(hào)’和‘湖景蜜露’果實(shí)隨著成熟度增加PpACS4基因表達(dá)逐漸上調(diào),而‘霞暉8號(hào)’八成熟果實(shí)的PpACS4基因表達(dá)量顯著高于七成熟和九成熟。Stonyhard型‘霞脆’果實(shí)隨成熟度增加PpACS4基因表達(dá)上調(diào),‘華玉’果實(shí)PpACS4基因表達(dá)量由大到小表現(xiàn)為八成熟、九成熟、七成熟,‘秦王’九成熟果實(shí)的PpACS4基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于八成熟和七成熟。不溶質(zhì)型‘弗雷德里克’和‘金童9號(hào)’隨著成熟度增加PpACS4基因表達(dá)逐漸上調(diào),‘金童8號(hào)’八、九成熟果實(shí)的PpACS4基因表達(dá)無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn),在不同肉質(zhì)桃果實(shí)中,隨著成熟度的增加,PpACS4基因在溶質(zhì)型果實(shí)中具有較高的表達(dá)量,而在Stonyhard型果實(shí)中表達(dá)量較低。

2.4.2PpACO1基因表達(dá)如圖6所示:不同溶質(zhì)型不同成熟度果實(shí)的PpACO1基因相對(duì)表達(dá)量不同。隨著成熟度的增加,軟溶質(zhì)型‘雨花露’七成熟果實(shí)的PpACO1基因表達(dá)量顯著高于八、九成熟,且八成熟果實(shí)的PpACO1基因表達(dá)量最低,‘奉化玉露’八成熟果實(shí)PpACO1基因表達(dá)量顯著高于七、九成熟,說(shuō)明同一肉質(zhì)不同品種間PpACO1基因表達(dá)水平差異較大。硬溶質(zhì)型八成熟果實(shí)的PpACO1基因表達(dá)量均高于七、九成熟。Stonyhard型‘霞脆’和‘華玉’八成熟果實(shí)PpACO1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于七成熟;‘秦王’七、八成熟的PpACO1基因表達(dá)量無(wú)顯著差異,且Stonyhard型在4種肉質(zhì)型桃中PpACO1基因表達(dá)水平最低。對(duì)不溶質(zhì)型果實(shí)而言,‘弗雷德里克’和‘金童9號(hào)’PpACO1基因相對(duì)表達(dá)量隨著成熟度的增加基因表達(dá)上調(diào);‘金童8號(hào)’果實(shí)PpACO1基因表達(dá)由大到小依次為八成熟、七成熟、九成熟。

3 討論

呼吸躍變型果實(shí)的乙烯生物合成在發(fā)育成熟過(guò)程中存在2個(gè)不同的調(diào)節(jié)系統(tǒng):系統(tǒng)Ⅰ和系統(tǒng)Ⅱ。系統(tǒng)Ⅰ產(chǎn)生的乙烯主要是調(diào)節(jié)正常生長(zhǎng)、發(fā)育和脅迫反應(yīng);系統(tǒng)Ⅱ主要是自我催化反應(yīng),負(fù)責(zé)花的凋亡和果實(shí)的成熟[16-17]。果實(shí)成熟被認(rèn)為是發(fā)生在果實(shí)發(fā)育后期一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)的過(guò)程[18],不同樹(shù)種以及同一樹(shù)種不同品種(基因型)間的果實(shí)成熟機(jī)制存在明顯差異。因此,進(jìn)一步探討不同肉質(zhì)不同品種果實(shí)成熟差異的生理和分子機(jī)制,對(duì)桃果實(shí)成熟的品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。本研究結(jié)果表明,PpACS1、PpACS4、PpACO1基因在不同肉質(zhì)型桃果實(shí)乙烯生物合成中起關(guān)鍵作用,是控制桃果實(shí)成熟軟化的主要因子,這與前人研究結(jié)果一致[11-12,19-20]。溶質(zhì)型(軟溶質(zhì)、硬溶質(zhì)、不溶質(zhì))桃果實(shí)在成熟過(guò)程中,九成熟果實(shí)的基因表達(dá)豐度最高。

呼吸躍變型果實(shí)成熟后期需要系統(tǒng)Ⅱ釋放大量的乙烯,從而促進(jìn)果實(shí)成熟軟化[17]。本試驗(yàn)中,不同成熟度(七、八、九成熟)不同肉質(zhì)型桃果實(shí)的乙烯生成能力有顯著差異,2個(gè)關(guān)鍵酶ACS和ACO相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)乙烯生物合成的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。本研究中溶質(zhì)型桃表現(xiàn)出明顯的呼吸躍變果實(shí)所具有的特征:呼吸速率隨成熟度的增加升高,乙烯釋放量明顯升高,果實(shí)硬度迅速下降;而Stonyhard型七、八、九成熟果實(shí)的呼吸速率相對(duì)平緩,乙烯釋放量極低,硬度隨成熟度的增加保持較高的水平,均高于溶質(zhì)型桃,表明Stonyhard型桃果實(shí)成熟期間由于缺少乙烯的釋放,導(dǎo)致果實(shí)成熟無(wú)法正常軟化。不同肉質(zhì)型桃果實(shí)在成熟階段乙烯釋放量的高低與PpACS1基因的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。RT-qPCR結(jié)果顯示,不同肉質(zhì)型桃果實(shí)PpACS1基因表達(dá)水平與乙烯釋放規(guī)律表現(xiàn)出高度的一致性,PpACS1基因在溶質(zhì)型桃果實(shí)中表現(xiàn)出較高的表達(dá)豐度,導(dǎo)致溶質(zhì)型桃成熟期間果實(shí)快速軟化;而Stonyhard型果實(shí)表達(dá)水平極低,這與前人研究結(jié)果一致[11,19],表明PpACS1基因表達(dá)受抑制是Stonyhard型果實(shí)乙烯合成受阻、果實(shí)無(wú)法正常軟化的主要原因。

桃果實(shí)軟化啟動(dòng)階段及軟化早期,果實(shí)乙烯含量增加緩慢,乙烯的大量釋放發(fā)生在果實(shí)成熟的軟化后期[5],是果實(shí)成熟、衰老的結(jié)果,也反過(guò)來(lái)加速衰老及軟化進(jìn)程,且溶質(zhì)型桃果實(shí)硬度迅速下降先于乙烯高峰的出現(xiàn)[21]。本研究中軟溶質(zhì)和不溶質(zhì)型七、八、九成熟果實(shí)硬度迅速下降,且九成熟果實(shí)乙烯釋放量最高,這與陸勝民等[22]對(duì)梅果實(shí)的研究結(jié)果一致。硬溶質(zhì)型九成熟果實(shí)硬度顯著高于軟溶質(zhì)型,但同一時(shí)期的乙烯釋放量明顯低于軟溶質(zhì)型,表明硬溶質(zhì)型桃果實(shí)的成熟軟化速度明顯低于軟溶質(zhì)型,更有利于采后貯藏和延長(zhǎng)貨架期,這與闞娟等[23]的研究結(jié)果一致。溶質(zhì)型桃九成熟果實(shí)的乙烯釋放量最高,且PpACS1、PpACS4基因的表達(dá)水平隨成熟度的增加顯著上調(diào);不同肉質(zhì)型桃PpACO1基因表達(dá)水平隨果實(shí)成熟度的增加有所差異,表明與乙烯生物合成的相關(guān)基因(PpACS1、PpACS4、PpACO1)共同調(diào)控果實(shí)的成熟及乙烯釋放。楊勇[3]、潘磊[14]和姜航等[24]在研究桃果實(shí)貯藏期間基因表達(dá)變化中均未檢測(cè)到PpACS2和PpACS3基因的表達(dá),本研究也未檢測(cè)到,同時(shí)在果實(shí)成熟期間PpACS5基因表達(dá)量也極低,可能這些基因的表達(dá)發(fā)生在果實(shí)發(fā)育期,這有待于進(jìn)一步研究。