俞雯雯,袁炳欽,馮汝晴,鄭鎮(zhèn)桂,劉靈銳,陳勇
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院雜草研究實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)
雜草是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要植物資源,但它會(huì)與作物爭(zhēng)奪水分、養(yǎng)料、光照、空間,降低農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì),妨礙作物收獲,影響糧食生產(chǎn)并造成經(jīng)濟(jì)損失。因此,防除雜草成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域長(zhǎng)期的研究課題。千金子[Leptochloachinensis(L.)Nees]是千金子屬一年生禾本科雜草,廣泛分布在各大水稻產(chǎn)區(qū)[1]。近年來,隨著水稻輕型栽培技術(shù)的大面積推廣和選擇性除草劑的普遍應(yīng)用,稻田雜草群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化,千金子在南方稻區(qū)發(fā)生并迅速蔓延,己經(jīng)成為僅次于稗草的惡性雜草,甚至在部分稻田的危害已經(jīng)超過稗草,是中國(guó)水稻田最難防除的惡性雜草之一,嚴(yán)重抑制水稻的生長(zhǎng)發(fā)育[2-5]。
目前,千金子防治主要依賴化學(xué)除草劑。然而化學(xué)農(nóng)藥的大量使用帶來雜草抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等嚴(yán)重問題,直接威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全[6]。近年來具有選擇性強(qiáng)、作物產(chǎn)生抗藥性概率低、對(duì)人體和環(huán)境安全性高等優(yōu)點(diǎn)的微生物除草劑逐漸受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的重視[7-9]。微生物除草劑指利用植物病原微生物或其代謝產(chǎn)物來防治雜草的制劑[10],文獻(xiàn)報(bào)道包括真菌和細(xì)菌在內(nèi)有40多個(gè)屬、80多個(gè)種的微生物具有防控雜草的能力[11]。在全球范圍內(nèi),市場(chǎng)上現(xiàn)有13種源自微生物或天然分子的生物除草劑[12-13]。而用來防治千金子的微生物除草劑報(bào)道甚少。
本課題組研究發(fā)現(xiàn)嘴突凸臍蠕孢菌(Exserohilumrostratum)對(duì)千金子具有較強(qiáng)的致病性,對(duì)水稻以及其他多種作物安全[14]。本研究通過測(cè)定不同pH值、培養(yǎng)溫度、光照、養(yǎng)分、碳氮源對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響,以及不同溫度、pH值和常用農(nóng)藥對(duì)孢子萌發(fā)的影響,進(jìn)而詳細(xì)研究其生物學(xué)特性及其孢子懸浮液與常用農(nóng)藥混配后孢子萌發(fā)特性,為該菌株的大批量生產(chǎn)和應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中提供相關(guān)數(shù)據(jù),并為其作為制劑的開發(fā)、利用奠定基礎(chǔ)。
嘴突凸臍蠕孢菌(Exserohilumrostratum)Y9511來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院雜草研究實(shí)驗(yàn)室,保藏編號(hào)為GDMCC No:60535。
8種農(nóng)藥為丙草胺[先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司]、惡唑酰草胺(美國(guó)富美實(shí)公司)、氰氟草酯(安徽眾邦生物工程有限公司)、莠滅凈(廣西易多收生物科技有限公司)、春雷霉素(華北制藥集團(tuán)愛諾限公司)、苯甲嘧菌酯(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)、多菌靈(安徽廣信農(nóng)化股份有限公司)、苯甲丙環(huán)唑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司),均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究實(shí)驗(yàn)室楊開強(qiáng)提供。
常規(guī)PDA培養(yǎng)基:40.1 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂,5~8 g瓊脂粉,1 000 mL H2O,121 ℃高壓滅菌30 min。完全培養(yǎng)基:100 g 蔗糖,0.5 g MgSO4·7H2O,3 g NH4NO3,0.1 g FeSO4·7H2O,2 g KH2PO4,17 g 瓊脂,1 000 mL H2O,121 ℃高壓滅菌30 min。缺少碳源、氮源、磷、硫、鉀、鐵、鎂培養(yǎng)基的配制見表1。
1.2.1 營(yíng)養(yǎng)元素按表1配制不同的培養(yǎng)基,分別接種菌株Y9511進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng),每個(gè)處理6次重復(fù)。30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量。
表1 不同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基的配方Table 1 Formula of different nutrient media g
1.2.2 微量元素銅和鋅在完全培養(yǎng)基(X1)中分別加入0.01%硫酸銅、硫酸鋅配制供試培養(yǎng)基,接種菌株Y9511后培養(yǎng),培養(yǎng)方法和產(chǎn)孢測(cè)定方法同1.2.1節(jié)。
1.2.3 碳源和氮源在去除碳源的完全培養(yǎng)基中分別加入100 g的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和α-乳糖配制出不同碳源的培養(yǎng)基,按1.2.1節(jié)的方法觀察產(chǎn)孢量。
1.2.4 溫度挑取適量菌株Y9511菌絲至PDA培養(yǎng)平板中央,分別置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、38、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個(gè)處理6次重復(fù)。14 d后用血球計(jì)數(shù)板鏡檢產(chǎn)孢量[15]。
1.2.5 初始pH值用1 mol·L-1的NaOH和HCl調(diào)節(jié)以配制pH值分別為3.02、4.60、5.20、6.24、7.83、8.60、9.50的PDA培養(yǎng)基,后接種菌株Y9511進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)處理6次重復(fù)。30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d后用血球計(jì)數(shù)板鏡檢產(chǎn)孢量。
1.3.1 溫度菌株Y9511培養(yǎng)7 d后,用無菌水洗下孢子,4層紗布過濾去除菌絲體,稀釋孢子懸液至每個(gè)視野約10個(gè)孢子備用,下同。取20 μL孢子懸液滴加在凹玻片的凹槽處,置于墊著濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),在5、10、15、20、25、28、30、32、35、37、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,使用顯微鏡觀察孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)處理重復(fù)4次,每個(gè)重復(fù)觀察100個(gè)孢子。孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/觀測(cè)孢子總數(shù)×100%。
1.3.2 初始pH值用1 mol·L-1的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)備用的孢子懸浮液pH值,使孢子懸浮液pH值分別為3.02、4.60、5.20、6.24、7.83、8.60、9.50,在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況,方法同1.3.1節(jié)。
1.3.3農(nóng)藥按農(nóng)藥的田間推薦劑量(1×)、亞致死劑量(0.2×)、次亞致死劑量(0.1×)算出每個(gè)培養(yǎng)皿(直徑90 mm)的使用量(保證每皿的有效成分不變)。按照表2用超純水稀釋配制不同基礎(chǔ)濃度的農(nóng)藥,與適量備用的孢子懸液充分混勻,加入載玻片后,置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),添加超純水至水面剛好浸沒載玻片,搖勻后在30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后鏡檢觀察孢子萌發(fā)狀況,以未加農(nóng)藥的培養(yǎng)皿作為空白對(duì)照,測(cè)定孢子萌發(fā)抑制率。每個(gè)處理重復(fù)3次。孢子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照萌發(fā)率-藥劑處理萌發(fā)率)/對(duì)照萌發(fā)率×100%[16]。
表2 農(nóng)藥稀釋表Table 2 Herbicides dilution table
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)結(jié)果方差分析后進(jìn)行Duncan’s多重比較檢驗(yàn)各處理間的差異。
從表3可見:與完全培養(yǎng)基(X1)相比,缺乏碳(X2)、磷(X4)、硫(X5)、鉀(X6)、鎂(X7)元素的培養(yǎng)基均顯著抑制Y9511菌株的生長(zhǎng),培養(yǎng)3~7 d的菌落直徑顯著受到抑制。缺乏氮(X3)、鐵(X8)元素處理下,菌株Y9511的生長(zhǎng)快于完全培養(yǎng)基(X1),在整個(gè)培養(yǎng)過程中與其他處理差異顯著。微量元素銅和鋅對(duì)菌株Y9511的生長(zhǎng)有顯著抑制作用,加入微量元素銅和鋅的培養(yǎng)基上菌株的菌落直徑在培養(yǎng)3、4、5、6和7 d時(shí)低于完全培養(yǎng)基(X1)。
表3 不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)嘴突凸臍蠕孢菌菌株Y9511菌絲生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of nutritional components on the growth of mycelium of Exserohilum rostratum strain Y9511
不同碳、氮源對(duì)Y9511菌落生長(zhǎng)影響不同。在供試的5種碳源中,以可溶性淀粉為碳源時(shí)Y9511生長(zhǎng)最快,與其他處理相比差異顯著,其次是D(+)-蔗糖。以葡萄糖、麥芽糖和α-乳糖為碳源的培養(yǎng)基,Y9511生長(zhǎng)較缺乏碳源培養(yǎng)基(X2)處理慢,且差異顯著(圖1)。加入供試的4種氮源后,與缺少氮源的培養(yǎng)基(X3)相比,菌株Y9511生長(zhǎng)均受到抑制,且差異顯著(圖2),說明菌株無法利用這4種氮源,加入氮源會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)。
從表4可見:菌株Y9511在缺乏元素碳、氮、磷、鎂、鐵的培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量顯著低于完全培養(yǎng)基(X1);與X1相比,缺鉀和缺銅的培養(yǎng)基上菌株Y9511不產(chǎn)孢,說明鉀和銅是菌株Y9511產(chǎn)孢必不可少的元素;缺硫和鋅的培養(yǎng)基菌株Y9511產(chǎn)孢量顯著高于X1,說明缺乏元素硫和鋅的培養(yǎng)基更有助于產(chǎn)孢。
表4 不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌株Y9511產(chǎn)孢量的影響Table 4 Effect of different nutrients on the spore-producing of strain Y9511
菌株Y9511在供試的5種碳源培養(yǎng)基中均能產(chǎn)孢,與以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基相比,以葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉為碳源菌株Y9511產(chǎn)孢量均顯著降低,表明產(chǎn)孢最適碳源為蔗糖。在供試的 4種氮源培養(yǎng)基中,以(NH4)2SO4作為氮源菌株Y9511不能產(chǎn)孢,以Ca(NO3)2和大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量顯著低于以NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基,且以NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量高于缺氮培養(yǎng)基,說明菌株Y9511產(chǎn)孢的最適氮源為NH4NO3。
由圖3可見:菌株Y9511除在5 ℃外的其他溫度下均可產(chǎn)孢,但低于15 ℃或高于35 ℃產(chǎn)孢量較小。在20~32 ℃,隨溫度升高產(chǎn)孢量顯著增加,其中在32 ℃培養(yǎng)14 d產(chǎn)孢量最大,達(dá)8.15×106mL-1,與其他處理差異顯著。
由圖4可見:菌株Y9511在pH3~9條件下均能產(chǎn)孢。產(chǎn)孢量以pH值6.24時(shí)最高,達(dá)2.77×106mL-1,與其他處理相比差異顯著;其次是pH值7.83和5.20。兩者差異不顯著;pH值為3.02和9.5時(shí)孢子數(shù)目最低,說明過酸或過堿均不利于該菌株的產(chǎn)孢。
從圖5可見:在5 ℃培養(yǎng)時(shí)菌株Y9511孢子不能萌發(fā);10~30 ℃培養(yǎng)下,菌株Y9511孢子萌發(fā)率隨溫度升高而增加,30 ℃時(shí)孢子萌發(fā)率最高,為98.5%,與其他處理差異顯著,之后隨溫度升高而下降。
菌株Y9511孢子在pH值3~9均能萌發(fā),萌發(fā)率為50%~90%,其中pH值為6.24時(shí),孢子萌發(fā)率最高,為85.8%,其次是pH7.83,為84.8%,兩者差異不顯著,但顯著高于其他處理(圖6)。表明該菌株Y9511孢子萌發(fā)最適pH值為6.24~7.83。
供試的8種農(nóng)藥對(duì)菌株Y9511孢子萌發(fā)均具有抑制作用,且因農(nóng)藥種類以及濃度的不同而呈現(xiàn)差異,抑制率為5.0%~89.4%(圖7)。除了氰氟草酯和苯甲丙環(huán)唑3種處理濃度下的萌發(fā)抑制率無顯著差異外,其他農(nóng)藥對(duì)孢子萌發(fā)抑制率均隨濃度增加而增加,其中惡唑酰草胺、莠滅凈、苯甲嘧菌酯的3種濃度間均有顯著差異。常規(guī)濃度下,苯甲嘧菌酯的抑制率最高,達(dá)89.4%,與其他處理相比差異顯著;其次是莠滅凈,抑制率為81.1%;最低為氰氟草酯,抑制率為7.0%;其他農(nóng)藥抑制率為19.5%~42.1%。亞致死濃度下,抑制率最高同樣是苯甲嘧菌酯,為61.8%,與其他組差異顯著;抑制率最低是氰氟草酯,為5.0%。次亞致死濃度下,抑制率為5.8%~25.6%,其中惡唑酰草胺、苯甲嘧菌酯、苯甲丙環(huán)唑抑制率較高,三者間無顯著差異??傊?菌株Y9511與供試農(nóng)藥氰氟草酯相容性最好,3種處理濃度下抑制率最高僅為7%;其次是多菌靈,3種濃度下抑制率為7.8%~19.5%;相容性最差的是苯甲嘧菌酯,其抑制率為25.1%~85.4%。
真菌除草制劑利用活的孢子和菌絲發(fā)揮其防治作用,但其應(yīng)用經(jīng)常受到各種非生物脅迫的影響,主要包括濕度、紫外線照射以及高溫,所以具有良好生長(zhǎng)特性的真菌菌株通常用于雜草的生物防治,且研究植物病原體生物學(xué)特性對(duì)于生物除草劑的開發(fā)具有重要意義[17-18]。
培養(yǎng)基是微生物發(fā)酵工業(yè)及微生物學(xué)研究的基礎(chǔ),目前常用培養(yǎng)基主要包括PDA、查氏、蛋白胨、清水瓊脂、完全培養(yǎng)基等[19]。已報(bào)道的對(duì)草莓根腐病菌、茄子褐紋病菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明,其最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;枸杞根腐病的致病菌之一的單隔鐮孢菌其最佳培養(yǎng)基為豆芽汁瓊脂培養(yǎng)基[20-21]。本研究中,通過完全培養(yǎng)基缺素培養(yǎng)探究了多種元素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響,研究結(jié)果表明,菌株Y9511生長(zhǎng)需要碳、磷、硫等3種元素,Y9511菌株的生長(zhǎng)受到氮、鐵的抑制,微量元素銅和鋅抑制Y9511菌株的生長(zhǎng);培養(yǎng)基添加元素碳、氮、磷、鎂、鐵促進(jìn)產(chǎn)孢,鉀和鋅不可或缺,缺硫有助于產(chǎn)孢。
真菌會(huì)對(duì)各種碳、氮源進(jìn)行選擇性利用,且其利用碳、氮源的能力也因真菌種類差異而有所差別[19]。本試驗(yàn)中,在供試的5種碳源中,菌株對(duì)可溶性淀粉和D(+)-蔗糖的利用率較好,而對(duì)于葡萄糖、麥芽糖和α-乳糖的利用率較弱;以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大,為1.47×106mL-1。在供試的4種氮源中,與缺少氮源的培養(yǎng)基相比,菌株生長(zhǎng)均受到抑制,說明菌株無法利用這4種氮源,且加入氮源會(huì)抑制菌株生長(zhǎng);4種氮源中,NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大,為1.47×106mL-1。
溫度與細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)關(guān)聯(lián)密切,影響酶促反應(yīng)速率和真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及代謝;pH值會(huì)影響真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及酶促反應(yīng)的效率,因此溫度、pH值是影響真菌生長(zhǎng)的重要因素[19]。本研究中,Y9511在低于15 ℃和高于35 ℃的條件下產(chǎn)孢受到抑制,32 ℃時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)到最大值,為8.15×106mL-1;pH值在低于3.02和高于9.50時(shí),產(chǎn)孢量較低,pH值為6.24時(shí),產(chǎn)孢量達(dá)到最大值,為2.77×106mL-1;30 ℃時(shí)孢子萌發(fā)率最高,達(dá)98.5%;pH值為6.24時(shí),孢子萌發(fā)率達(dá)到最大值,為85.8%。研究結(jié)果與陳勇等[22]對(duì)尖角突臍孢的生物學(xué)特性研究具有相似之處,如產(chǎn)孢適合溫度相差不大,硝酸銨作為氮源產(chǎn)孢水平較好;但因?yàn)榫甑木N不同也存在一定的差異,如菌株生長(zhǎng)的最適pH值和碳源不同。菌株Y9511在田間利用最好避開夏季高溫或冬季低溫時(shí)節(jié)。然而,在實(shí)際應(yīng)用中,對(duì)于嘴突凸臍孺孢菌控制千金子所需的溫度、濕度、初始pH以及光照條件仍有待研究。
目前,千金子對(duì)多種除草劑產(chǎn)生交互抗性,針對(duì)化學(xué)除草劑使用面臨的環(huán)境、食品安全等問題以及對(duì)雜草綠色防控技術(shù)的需求,研發(fā)新型生物除草劑已經(jīng)成為雜草防控的研究重點(diǎn)。但現(xiàn)階段農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,生物除草劑的使用還是無法替代化學(xué)除草劑。研究發(fā)現(xiàn),微生物除草劑與某些低劑量的化學(xué)除草劑復(fù)配使用能有效提高防除效果,且復(fù)配使用能夠減少化學(xué)除草劑的相對(duì)使用量,從而在一定程度上降低化學(xué)除草劑對(duì)環(huán)境危害[23-25];復(fù)配使用能夠有效擴(kuò)大單一菌體的殺草譜,從一定程度上降低防除雜草的成本,以及改變菌體對(duì)寄主的專一選擇性等多種作用[26]。因此,對(duì)于生物除草劑與化學(xué)除草劑混配使用的研究對(duì)除草劑開發(fā)具有重大意義。本文通過對(duì)嘴突凸臍蠕孢菌與不同化學(xué)農(nóng)藥混配的孢子萌發(fā)率評(píng)價(jià)了其與化學(xué)農(nóng)藥混配使用的可能性。通過與8種農(nóng)藥的混配,我們得出:供試農(nóng)藥中,氰氟草酯和莠滅凈對(duì)該菌株孢子萌發(fā)影響較小,相容性最好,而苯甲嘧菌酯對(duì)孢子萌發(fā)影響最大,相容性最差。與農(nóng)藥混配時(shí),最好選用對(duì)菌株孢子萌發(fā)抑制率較低的農(nóng)藥。
本研究對(duì)嘴突凸臍蠕孢菌菌株Y9511的生物學(xué)特性結(jié)果表明,將其作為生物除草劑進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)是可行的,且與化學(xué)農(nóng)藥混配的孢子萌發(fā)試驗(yàn)表明,其作為生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥混配使用是可行的,但對(duì)混配后的實(shí)際應(yīng)用以及效果還需進(jìn)一步探究。嘴突凸臍蠕孢菌作為微生物除草劑很有潛力,但對(duì)其致病機(jī)制以及具體侵染過程尚有待進(jìn)一步研究。