陳靜,魯秀梅,任琴琴,孫亞亭,包衛(wèi)紅,陳雯倩,錢(qián)春桃*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095;2.海門(mén)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 南通 226100)

circRNA(circular RNA)是生物體內(nèi)廣泛存在的環(huán)狀非編碼RNA,由外顯子或內(nèi)含子序列剪切產(chǎn)生,大量存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[1]。近年來(lái)研究表明,在生物體內(nèi),circRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA)結(jié)合miRNA,剪接和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子以及親本基因表達(dá)的修飾因子在細(xì)胞分化和發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。在動(dòng)物中,研究發(fā)現(xiàn)circRNA在疾病發(fā)生[3]、細(xì)胞分化[4]等方面具有重要作用。在植物上的研究主要圍繞組織特異性[5]、果實(shí)發(fā)育[6]等方面,且大多集中在擬南芥[7]、水稻[8]等模式植物。

在植物抗病育種方面,Ghorbani等[9]認(rèn)為玉米接種伊朗花葉病毒前、后差異表達(dá)的circRNA可能影響植物的代謝和發(fā)育。Wang等[10]研究表明獼猴桃circRNA的表達(dá)具有組織特異性和物種特異性,并在植物免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Wang等[11]在番茄黃葉卷曲病毒侵染前、后的番茄植株中分別篩選出32個(gè)和83個(gè)特異表達(dá)的circRNA,認(rèn)為其靶基因沉默導(dǎo)致番茄黃葉卷曲病毒積累減少。李冰冰等[12]在泡桐中鑒定出50個(gè)circRNA,且在健康泡桐苗和感叢枝病泡桐苗中差異表達(dá),表明circRNA在泡桐抗叢枝病中發(fā)揮重要作用。

蔓枯病是甜瓜主要病害之一,其嚴(yán)重影響甜瓜的產(chǎn)量及品質(zhì)。目前,關(guān)于甜瓜抗蔓枯病的研究主要集中于分子標(biāo)記的篩選和等位性檢測(cè)[13]等方面,而在非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平方面尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以抗病材料PI420145和感病品種‘白皮脆’自交系作為材料,在接種蔓枯病菌前、后取樣,構(gòu)建circRNA庫(kù),對(duì)其進(jìn)行雙端測(cè)序,篩選差異表達(dá)的circRNA,并進(jìn)行抗蔓枯病基因驗(yàn)證及靶基因結(jié)構(gòu)域分析,以獲得甜瓜抗蔓枯病相關(guān)circRNA,揭示circRNA在甜瓜抗蔓枯病中的作用,旨在為甜瓜抗病育種研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蔓枯病抗性材料PI420145(A)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供;蔓枯病感病品種‘白皮脆’(B)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)多代自交留種。

蔓枯病菌采用A型菌株,由本實(shí)驗(yàn)室提供。采用李英等[14]的方法分離純化菌株,采用PDA培養(yǎng)基在(25±1)℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d,然后在紫外條件(光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h)下培養(yǎng)4 d,使其產(chǎn)生大量分生孢子。

1.2 蔓枯病菌分生孢子懸浮液配制和蔓枯病接種

在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子配成濃度為5×105mL-1的孢子懸浮液,加乳酸將pH值調(diào)至3.5～4.0,再加入20滴Tween 20增加表面活性。參照Z(yǔ)hang等[15]的方法,待植株長(zhǎng)至3葉1心時(shí),使用手持噴霧器,進(jìn)行人工噴霧接種,莖部及葉片正、反面均噴到滴水為止。接種后置于相對(duì)濕度和相對(duì)溫度分別為95%和28 ℃左右的人工氣候室中。

1.3 RNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

在接種蔓枯病菌前(0 d)和接種后(2 d)對(duì)PI420145和‘白皮脆’取樣,取植株全部完全展開(kāi)的功能葉,每個(gè)樣品3次重復(fù)。采用Trizol試劑法提取葉片總RNA。根據(jù)說(shuō)明書(shū),取5 μg Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Epicentre)移除核糖體RNA,Rnase R(Epicentre)移除線(xiàn)性RNA,TRIzol Reagent(Invitrogen)純化RNA,使用NEBNext?Ultra Directional RNA Library Prep Kit(NEB)構(gòu)建RNA文庫(kù)。Agencourt AMPure XP Magnetic Beads(Beckman)篩選長(zhǎng)度為350～550 bp的片段,在Hiseq X10 平臺(tái)上機(jī)測(cè)序,策略為PE150,即雙端測(cè)序(pair-end)測(cè)序模式,即從最左端測(cè)150 bp,再?gòu)淖钣叶藴y(cè)150 bp。

1.4 circRNA的鑒定

使用inhouse Perl腳本過(guò)濾fastq格式的原始reads,以刪除包含adapter或ploy-N和低質(zhì)量的reads。將所得到的reads利用TopHat算法比對(duì)到甜瓜參考基因組DHL92(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Cucumis_melo/)。使用CIRCexplorer識(shí)別circRNA,并對(duì)其中沒(méi)有比對(duì)到基因組的reads用TopHat-Fusion再次比對(duì),尋找 back-spliced reads,最后將比對(duì)到相同位置的 read count>2 的 junction reads 作為新鑒定的 circRNA。

1.5 差異表達(dá)circRNA的篩選及分析

使用TPM(Transcripts PerMillion)對(duì)circRNA的表達(dá)進(jìn)行歸一化。差異表達(dá)circRNA的輸入數(shù)據(jù)為readcount數(shù)據(jù)。使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2分析帶有生物重復(fù)的樣本。

利用火山圖推斷差異表達(dá)circRNA的分布。通過(guò)評(píng)估差異倍數(shù)(fold change)和校正后的顯著水平(padj)2個(gè)方面來(lái)篩選差異表達(dá)的circRNA。對(duì)于有生物重復(fù)的樣本,篩選條件為padj<0.05。對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.6 circRNA靶基因的富集分析

根據(jù)circRNA與其靶基因間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,對(duì)每組差異表達(dá)circRNA的靶基因集合分別進(jìn)行Gene Ontology 和KEGG富集分析。其中GO富集分析方法為GOseq,經(jīng)校正后統(tǒng)計(jì)GO注釋的候選靶基因數(shù),并以柱狀圖的形式展示。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)對(duì)靶基因進(jìn)行注釋,將P值小于0.05的Pathway定義為在候選靶基因中顯著富集的Pathway。

1.7 靶基因的篩選及分析驗(yàn)證

篩選差異表達(dá)的circRNA,利用NCBI Conserved Domain Search Service(CD Search)平臺(tái)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行靶基因保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。

使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,SYBRPremixExTaqTM(TaKaRa)試劑盒及CFX 96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行Real-time PCR?？偡磻?yīng)體系為20 μL,其中Template cDNA 1 μL,SYBR(-20 ℃)10 μL,前引物0.5 μL,后引物0.5 μL,ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃30 s,95 ℃5 s,55 ℃30 s,72 ℃30 s,共 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。以甜瓜Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量,并根據(jù)單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著分析。引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜抗性表型鑒定

由圖1可見(jiàn):接種蔓枯病菌后3 d,抗病材料PI420145無(wú)明顯癥狀,而感病品種‘白皮脆’表現(xiàn)典型的蔓枯病感染癥狀,即接種葉片已經(jīng)出現(xiàn)褪綠變黃,病斑中心出現(xiàn)輪紋狀病斑,所以選擇接種后2 d的無(wú)病癥葉片用于文庫(kù)制備和RNA測(cè)序。

2.2 甜瓜circRNA的鑒定

經(jīng)過(guò)濾,PI420145接種蔓枯病菌前(A0)和接種后(A2)分別得到102 710 802和92 350 890 條clean reads;‘白皮脆’接種前(B0)和接種后(B2)分別得到105 019 117 和95 093 825條clean reads。同時(shí),A0、A2、B0和B2分別保留了30.81、27.71、31.51和28.52 Gb的clean bases。本試驗(yàn)共鑒定出來(lái)自12個(gè)文庫(kù)的1 511個(gè)circRNA。在A0和B0中分別鑒定出626個(gè)和609個(gè)circRNA,在A2和B2中分別鑒定出 499個(gè)和374個(gè)circRNA。在A0和B0中,相同的circRNA有158個(gè);在A2和B2中,相同的circRNA有105個(gè)(圖2)。與A0相比,A2的circRNA數(shù)量減少20.29%;與B0相比,B2的circRNA數(shù)量減少38.59%。

2.3 甜瓜差異表達(dá)circRNA的篩選及分析

在PI420145和‘白皮脆’接種蔓枯病菌前、后的12個(gè)文庫(kù)中篩選差異表達(dá)的circRNA并進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)A0和B0共鑒定出64個(gè)差異表達(dá)的circRNA,其中21個(gè)表達(dá)上調(diào),43個(gè)表達(dá)下調(diào),表明 circRNA 在不同品種中存在明顯差異。A2和A0中有30個(gè)差異表達(dá)circRNA,4個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào),26個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào),只有2個(gè)circRNA在兩者中均有表達(dá);B2和B0中有47個(gè)差異表達(dá)的circRNA,其中3個(gè)表達(dá)上調(diào),44個(gè)表達(dá)下調(diào),在兩者間都有表達(dá)的circRNA只有3個(gè),說(shuō)明接種蔓枯病會(huì)引起甜瓜circRNA的變化,但在抗感品種中的反應(yīng)有差異。A2和B2有9個(gè)差異表達(dá)circRNA,其中4個(gè)表達(dá)上調(diào)、5個(gè)表達(dá)下調(diào),只有1個(gè)circRNA都有表達(dá),說(shuō)明在甜瓜不同品種中,病害的侵染會(huì)引起circRNA不同的表達(dá)。

2.4 差異表達(dá)circRNA靶基因的功能分析

對(duì)接種蔓枯病菌前、后差異表達(dá)的circRNA的靶基因進(jìn)行GO富集和基因數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示,在 A0 vs B0 中,共發(fā)現(xiàn)38個(gè)差異表達(dá)的circRNA靶基因,這些靶基因主要富集于3-羥基?；o酶α脫氫酶、氧化還原酶、鈣調(diào)蛋白結(jié)合和絡(luò)合物合酶等條目,其中分子功能(molecular function)類(lèi)型中富集于氧化還原酶活性調(diào)控的基因數(shù)最多。在A2 vs A0中,共獲得48個(gè)差異表達(dá)circRNA的靶基因,主要功能涉及應(yīng)激反應(yīng)、小分子代謝、脂肪酸代謝、鈣調(diào)蛋白結(jié)合以及絡(luò)合物合酶和氧化還原酶活性調(diào)控,其中在生物學(xué)過(guò)程(biological process)類(lèi)別中響應(yīng)刺激的基因數(shù)最多。B2 vs B0中,有53個(gè)差異表達(dá)circRNA的靶基因被富集到芳香族氨基酸生物合成代謝、雙糖生物合成、絡(luò)合酶活性調(diào)控、異構(gòu)酶活性調(diào)控和催化活性調(diào)控等條目,其中催化活性調(diào)控的基因數(shù)最多。在A2 vs B2中,共發(fā)現(xiàn)45個(gè)差異表達(dá)的circRNA靶基因,這些靶基因的主要功能與芳香氨基化合物的生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、有機(jī)環(huán)化合物的生物合成、細(xì)胞通路、細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)以及生物和細(xì)胞的調(diào)控相關(guān)(圖4)。

進(jìn)一步用KEGG信號(hào)通路對(duì)circRNA的靶基因進(jìn)行注釋分類(lèi),發(fā)現(xiàn)在A0 vs B0中,差異表達(dá)的circRNA靶基因富集在20個(gè)通路中,主要體現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,甘油磷脂代謝,氨基酸生物合成和代謝途徑。在A2 vs A0中,只有在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中富集。B2 vs B0 中有4條通路富集,分別為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,氨基酸的生物合成,次生代謝物的生物合成和代謝途徑。在A2 vs B2中,差異circRNA靶基因在5個(gè)通路中富集(表2)。

表2 候選靶基因的KEGG信號(hào)通路分析(A2 vs B2)Table 2 KEGG signaling pathway analysis of candidate target gene(A2 vs B2)

2.5 靶基因篩選及分析驗(yàn)證

2.5.1 靶基因篩選通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn),在PI420145中4個(gè)circRNA在接種蔓枯病菌前低表達(dá)或不表達(dá),而在接種后表達(dá)上調(diào)(圖3)。這些circRNA在基因組上的ID分別為NC_015983.1:137297-138107:-、NW_007546319.1:719750-720112:+、NW_007546268.1:4337793-4338189:-和NW_007546281.1:654424:+,分別位于0、11、12和3號(hào)染色體上。NC_015983.1:137297-138107:-為新鑒定的circRNA,其靶基因命名為gene22730,基因序列如圖5所示,位于葉綠體基因組。同時(shí),‘白皮脆’中有3個(gè)circRNA在接種前低表達(dá)或不表達(dá),而在接種后表達(dá)上調(diào)(圖3),分別為NW_007546268.1:4337793-4338189:-、NW_007546270.1-6727758:+和NW_007546307.1:176799-177080:+,分別位于12、5和3號(hào)染色體上。ID為NW_007546268.1:4337793-4338189:-的circRNA在PI420145和‘白皮脆’接種后都有表達(dá)(表3)。

表3 PI420145和‘白皮脆’接種蔓枯病菌前、后特異表達(dá)的circRNA
Table 3 The circRNA of differential expression in PI420145 and‘Baipicui’

before and after inoculation ofD.bryoniae

類(lèi)型Type染色體ChromosomecircRNA編號(hào)ID of circRNA靶基因Target genesA2 vs A00NC_015983.1:137297-138107:-gene2273011NW_007546319.1:719750-720112:+MELO3C02231012NW_007546268.1:4337793-4338189:-MELO3C0025603NW_007546281.1:654098-654424:+MELO3C010763B2 vs B012NW_007546268.1:4337793-4338189:-MELO3C0025605NW_007546270.1:6727341-6727758:+MELO3C0043783NW_007546307.1:176799-177080:+MELO3C019790

2.5.2 基于RT-qPCR的靶基因驗(yàn)證由圖6可知:在PI4201245中,靶基因gene22730、MELO3C022310、MELO3C002560和MELO3C019790在接種蔓枯病菌前低表達(dá),接種后表達(dá)上調(diào),其中基因gene22730、MELO3C022310和MELO3C002560均顯著上調(diào)。在‘白皮脆’中,靶基因MELO3C002560、MELO3C004378和MELO3C010763在接種前低表達(dá),接種后表達(dá)上調(diào),其中基因MELO3C004378和MELO3C010763顯著上調(diào),這與測(cè)序結(jié)果一致,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可靠。由于circRNA的表達(dá)與靶基因呈線(xiàn)性相關(guān),因此基因gene22730、MELO3C022310、MELO3C002560和MELO3C010763可能為甜瓜PI420145抗蔓枯病相關(guān)基因。

2.5.3 基于保守結(jié)構(gòu)域的靶基因驗(yàn)證利用NCBI conserved domain在線(xiàn)預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)基因MELO3C022310編碼組氨酸激酶,在516～803和1 073～1 606核苷酸處有CHASE 家族結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是存在于受體樣蛋白的胞外部分,編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶和腺苷酸環(huán)化酶等酶;在2 349～2 402核苷酸處存在HisKA結(jié)構(gòu)域,其與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān);在3 477～3 758核苷酸處有HATPase 家族,包含組氨酸激酶樣ATP酶(HATPase)結(jié)構(gòu)域,同樣與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。靶基因MELO3C002560編碼棉纖維表達(dá)蛋白,存在DUF761結(jié)構(gòu)域?；騇ELO3C010763編碼液泡加工酶樣蛋白,在268～321、2 431～2 805、3 432～3 533這3個(gè)核苷酸區(qū)域含有CASc家族,該家族編碼半胱氨酸依賴(lài)的天冬氨酸導(dǎo)向蛋白酶。MELO3C019790基因編碼分支酸合酶,該酶與芳香族氨基酸的合成有關(guān)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)2種材料接種蔓枯病菌后circRNA的數(shù)量均比接種前減少,且‘白皮脆’中的circRNA變化更大,這與Xiang等[16]的研究結(jié)果一致。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),接種前、后PI420145和‘白皮脆’中均產(chǎn)生種類(lèi)和數(shù)量存在差異的circRNA,其中PI420145中差異表達(dá)的circRNA數(shù)少于‘白皮脆’,但上調(diào)表達(dá)的 circRNA 較多,說(shuō)明二者的防御機(jī)制不同,這與番茄接種晚疫病病菌后相關(guān)circRNA的變化一致[17]。

差異表達(dá)circRNA靶基因功能分析的結(jié)果說(shuō)明,PI420145可以激活更多的有效途徑來(lái)應(yīng)對(duì)蔓枯病菌的侵入。A2 vs A0中,靶基因MELO3C022310和MELO3C010763參與響應(yīng)外界刺激、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中MELO3C022310基因的KEGG 富集通路顯示與玉米素的生物合成有關(guān),這與高粱感染炭疽病的代謝組學(xué)研究結(jié)果一致[18]。在B2 vs B0中,MELO3C004378基因與DNA和RNA的合成相關(guān)。研究表明,MELO3C022310基因中保守結(jié)構(gòu)域與植物抗病過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[19]。MELO3C002560基因的DUF761結(jié)構(gòu)域編碼的DUF蛋白在擬南芥中參與植物的防御反應(yīng)[20]。MELO3C010763基因編碼的蛋白酶介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[21]。MELO3C019790基因與芳香族氨基酸的合成有關(guān),而芳香族氨基酸與植物抗病過(guò)程相關(guān)[22]。NC_015983.1:137297-138107:-的靶基因gene22730定位于甜瓜葉綠體基因組上,擬南芥葉綠體基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的circRNA含量較高,可能是circRNA產(chǎn)生的熱區(qū)之一。根據(jù)現(xiàn)有研究還不能判斷其是否與蔓枯病抗性有關(guān),還需要對(duì)其合成過(guò)程、發(fā)揮位點(diǎn)及作用進(jìn)一步研究。

本研究中,circRNA在調(diào)控甜瓜PI420145對(duì)蔓枯病侵入的防御反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。借鑒番茄芝麻斑病侵染過(guò)程的研究[23],推測(cè)蔓枯病菌侵染后,甜瓜的第1道防線(xiàn)是物理防御,即蠟質(zhì)層;當(dāng)蔓枯病菌穿透蠟質(zhì)層后,PI420145中的circRNA啟動(dòng)響應(yīng)外界刺激的基因,激活茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的防御信號(hào)和相關(guān)途徑[24],促進(jìn)芳香族氨基酸化合物合成。盡管蔓枯病菌侵入時(shí),‘白皮脆’和PI420145都啟動(dòng)了防御反應(yīng),但可能PI420145對(duì)蔓枯病的識(shí)別時(shí)間更短,防御反應(yīng)更迅速持久,避免進(jìn)一步的傷害;而‘白皮脆’對(duì)蔓枯病的識(shí)別反應(yīng)較慢,信號(hào)較弱,從而導(dǎo)致蔓枯病菌的繁殖和轉(zhuǎn)移,最終使植株壞死。下一步研究將在PI420145對(duì)蔓枯病抗性基因克隆和表達(dá)分析的基礎(chǔ)上,從組織解剖結(jié)構(gòu)學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)等不同層面,系統(tǒng)地研究甜瓜PI420145對(duì)蔓枯病的防御特征,準(zhǔn)確揭示其抗性形成機(jī)制。