撖冬榮，侯 棟，姚 拓，蘭曉君，朱瑞婷

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070)

為了獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品，我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在不合理施肥現(xiàn)象，不僅是對(duì)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，且會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡，破壞土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[2]，影響土壤酸堿度，繼而導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，生態(tài)環(huán)境被破壞。因此，從綠色農(nóng)業(yè)以及生態(tài)環(huán)境保護(hù)等多方面綜合考慮，科學(xué)家們建議以微生物肥料代替部分化肥，以改良土壤，增加土壤微生物多樣性、透氣性和保水保肥能力等，同時(shí)這也是提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境的主要途徑[3]。

根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指能夠在植物根際(根際土壤、根系表面、根內(nèi)組織)定殖、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用、抑制有害生物危害的有益菌類(lèi)[4]。通過(guò)從不同植物分離篩選出的PGPR，利用其固氮、溶磷、分泌植物生長(zhǎng)激素等優(yōu)良特性及提高植物抗病抗逆性研制微生物菌肥，與化肥合理配比可以減少化肥施用量[5]。目前已有研究證明PGPR對(duì)于植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量具有積極的促進(jìn)作用，有研究報(bào)道PGPR能夠促進(jìn)馬鈴薯、辣椒、番茄、茄子、黃瓜、甘藍(lán)和蘿卜的生長(zhǎng)并能提高產(chǎn)量[6-7]；王明友等[8]、劉軍輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)微生物肥料對(duì)黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用，其顯著提高黃瓜凈光合速率、坐果率、產(chǎn)量，并降低硝酸鹽含量，因此，篩選出優(yōu)良菌株為研制微生物菌肥提供菌種資源。

萵筍(Lactucasativa)又稱萵苣，其莖、葉均可食用。萵筍含有多種維生素、蛋白質(zhì)及人體所需的多種微量元素，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤和抗癌等保健功能，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是人們喜食的蔬菜[10-11]。其在甘肅地區(qū)種植廣泛，隨著人們對(duì)綠色無(wú)公害蔬菜的要求以及萵筍市場(chǎng)需求的擴(kuò)大，提高萵筍產(chǎn)量和品質(zhì)，種植無(wú)公害蔬菜已成為關(guān)注熱點(diǎn)。但其根際促生菌資源篩選及微生物接種劑(菌肥)尚少見(jiàn)報(bào)道。

本研究從來(lái)自不同地點(diǎn)的萵筍根部分離PGPR菌株，通過(guò)定性、定量測(cè)試，篩選獲得具有溶磷、固氮、分泌IAA并具有生物防治作用的有益菌株，并利用分子生物學(xué)結(jié)合部分形態(tài)學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定，以期為萵筍微生物接種劑(菌肥)研制提供優(yōu)良菌株，并為研發(fā)微生物菌肥提供菌種，同時(shí)豐富我國(guó)PGPR菌種資源庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品為2018年10月分別采自甘肅省天水市武山洛門(mén)鎮(zhèn)文家寺2株、武山洛門(mén)鎮(zhèn)冶拂村1株、武山洛門(mén)鎮(zhèn)林家莊1株長(zhǎng)勢(shì)均較好的萵筍，完整采集根系，放入采樣箱(保溫4℃)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離，初步獲得PGPR菌株。

供試病原菌：黃瓜枯萎病(Fusariumoxysporum)、番茄早疫病(Alternariasolani)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(Pikovaskaia’s，簡(jiǎn)稱 PKO)[12]；有機(jī)磷培養(yǎng)基(蒙金娜培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱 MJN)[13]；LB固體培養(yǎng)基(Luria-Bertani，簡(jiǎn)稱LB)；LB液體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基不添加瓊脂[14]；金氏(King)培養(yǎng)基[15]；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dex-trose agar，PDA)培養(yǎng)基[16]；固氮培養(yǎng)基(nitrogen free medium, NFM)培養(yǎng)基[17]；多碳源低氮(CCM)培養(yǎng)基[18]。

1.3 根際促生菌分離篩選及測(cè)定方法

1.3.1 溶磷菌分離篩選 將萵筍根系分為2個(gè)部分，即根系表面(surface of roots,RP)和根內(nèi)組織(interior of roots，HP)。利用稀釋梯度法將上述2部分分別依次制備成濃度為10-1、10-2、10-3的稀釋液。利用平板涂布法，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，選取PKO和MJN培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快、菌落形態(tài)較大，菌落周?chē)霈F(xiàn)溶磷圈(透明圈)的不同單菌落，用接種環(huán)挑取具有溶磷圈的單菌落，進(jìn)行平板四區(qū)劃線法重復(fù)操作，直至菌株純化，即為溶磷菌株。

1.3.2 溶磷菌溶磷特性測(cè)定 (1)定性測(cè)定：將25株P(guān)GPR菌株分別接種于有機(jī)磷培養(yǎng)基(MJN)和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(PKO)上，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以十字交叉劃線的方法將溶磷菌在每個(gè)培養(yǎng)基上接種4個(gè)對(duì)稱區(qū)域，接種后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(28℃，7 d)，每天記錄溶磷圈大小(D代表溶磷圈直徑，d代表菌落直徑)進(jìn)行初步篩選[19-20]。(2)定量測(cè)定：選取培養(yǎng)后D/d>1.5的溶磷菌株，將篩選出的菌株接種于裝有50 mL已滅菌(121℃，30 min)LB液體培養(yǎng)基中于28℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)7～10 d。取培養(yǎng)液8 mL于4℃ 9 000 r·min-1條件下，離心15 min，取上清液5 mL于100 ml三角瓶中，同時(shí)加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液45 mL和2 g無(wú)磷活性炭搖勻，置于搖床(180 r·min-1，30 min)搖動(dòng)，30 min后用無(wú)磷濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取濾液10 mL于50 mL容量瓶中，采用鉬藍(lán)比色法對(duì)菌株溶磷量進(jìn)行測(cè)定[21]。

1.3.3 分泌IAA特性測(cè)定 (1)定性測(cè)定：將23株P(guān)GPR菌株接種于盛有已滅菌(121℃，30 min)的50 mL King液體培養(yǎng)基(冷卻至室溫)的150 mL細(xì)口三角瓶中，每菌株3次重復(fù)，以不接菌培養(yǎng)基為對(duì)照，在28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)10～12 d。吸取各菌液50 μL于白瓷板上，加50 μL Spot比色液，其中對(duì)照加50 μL濃度為0.01‰的3-吲哚乙酸，每處理3次重復(fù)，將白瓷板放置于室溫黑暗條件下，20 min內(nèi)觀察并記錄顏色變化。如變粉紅色即能分泌IAA，顏色深淺與分泌IAA能力呈正相關(guān)，沒(méi)有顏色變化即為不能分泌 IAA[22]。(2)定量測(cè)定：取上述篩選出菌株的培養(yǎng)液于4℃、10 000 r·min-1條件下，離心10 min，取上清液5 mL加等體積S2比色液，在黑暗下靜置30 min后迅速用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)530 nm下測(cè)定各待測(cè)液的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)液的IAA濃度(μg·mL-1)[23-24]。

1.3.4 固氮菌分離篩選 利用平板涂布法[25]將制備好的各濃度(10-1、10-2、10-3)稀釋液分別接種到NFM培養(yǎng)基和CCM培養(yǎng)基中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，進(jìn)行平板四區(qū)劃線法重復(fù)操作，直至菌株純化，即為固氮菌株。利用試管斜面保存法將篩選純化的固氮菌株置于4℃冰箱保存，備用[26]。

1.3.5 固氮菌固氮能力測(cè)定 采用乙炔還原法對(duì)初步篩選的固氮菌株進(jìn)行定量測(cè)定[27-28]。用接種環(huán)分別將20株P(guān)GPR菌株接種于盛有5 mL半固體NFM培養(yǎng)基的10 mL血清瓶中，每株菌3次重復(fù)，以不接菌培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)結(jié)束之后用50 μL平口微量進(jìn)樣器從血清瓶中分別抽取混合氣體50 μL快速注入到氣相色譜儀氣體進(jìn)樣柱內(nèi)[29]，記錄并觀察C2H4出峰時(shí)間及峰面積百分比，計(jì)算出菌株固氮酶活性。

1.3.6 菌株生防能力測(cè)定 利用平板對(duì)峙法篩選溶磷能力較好的10株優(yōu)良PGPR菌株對(duì)黃瓜枯萎病(Fusariumoxysporum)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)的拮抗作用。將10株P(guān)GPR菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法在PDA培養(yǎng)基中心位置分別接種病原菌，在十字兩端距中心位置22 mm處接種供試菌株，每個(gè)處理3次重復(fù)，并設(shè)置對(duì)照組(平板中央只接種病原菌)，置于培養(yǎng)箱在28℃下培養(yǎng)5～10 d，當(dāng)對(duì)照長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，以確定10株P(guān)GPR菌株對(duì)2種病原菌的生防能力[30-31]。

抑菌率(%)=[(D-d)/D]×100

式中，D為對(duì)照菌落直徑，d為處理菌落直徑。

1.3.7 優(yōu)良PGPR菌株鑒定 將上述分離篩選得到溶磷能力較高菌株P(guān)GBA2、MGBC2，分泌IAA能力較高菌株MGBD1、NGNB3，固氮酶活性較高菌株GND5、GNA6、GNB6，生防能力較強(qiáng)菌株MGBC3、MGNB4共9種優(yōu)良PGPR菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于離心管中，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測(cè)，觀察擴(kuò)增片段的純度并測(cè)定DNA濃度[32]。將測(cè)序結(jié)果在EZBioCloud的16S-basedID中進(jìn)行同源序列比較分析，采用Mega 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建所測(cè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值為1 000次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良根部促生菌篩選結(jié)果

通過(guò)PKO、MJN、NFM、CCM選擇性培養(yǎng)基從不同地點(diǎn)萵筍根部分離、篩選出溶磷菌株25株(溶解有機(jī)磷菌株19株，溶解無(wú)機(jī)磷菌株6株)，分泌植物生長(zhǎng)激素(IAA)菌株14株，固氮菌株20株，抑制病原菌菌株10株(見(jiàn)表1)。

表1 優(yōu)良根部促生菌篩選結(jié)果

2.2 溶磷菌株篩選及其溶磷能力

通過(guò)PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和MJN有機(jī)磷培養(yǎng)基分離篩選出具溶磷能力的PGPR菌株25株，其中溶解無(wú)機(jī)磷菌株6株，溶解有機(jī)磷菌株19株(表2、表3)。6株溶解無(wú)機(jī)磷菌株溶磷量在55.28～291.99 μg·mL-1之間，各菌株培養(yǎng)液pH值在4.42～5.87之間，其中以PGBA2菌株的溶磷量最大，為291.99 μg·mL-1。另外，19株溶解有機(jī)磷菌株溶磷量在6.49～76.11 μg·mL-1之間，各菌株培養(yǎng)液pH值在6.83～8.27之間，其中以MGBD2菌株的溶磷量最大，為76.11 μg·mL-1。

表3 優(yōu)良PGPR菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力 Table 3 The ability of excellent PGPR strain in dissolving inorganic P

表2 優(yōu)良PGPR菌株溶解有機(jī)磷能力

2.3 優(yōu)良PGPR分泌生長(zhǎng)激素(IAA)的能力

通過(guò)測(cè)定上述篩選出的14株優(yōu)良菌株其分泌植物生長(zhǎng)激素(IAA)的能力發(fā)現(xiàn)，7株菌株具有分泌IAA的能力，分泌量在0.78～5.29 μg·mL-1之間，其中以MGBD1菌株分泌生長(zhǎng)激素的能力最大，為5.29 μg·mL-1，菌株MGNB2分泌植物生長(zhǎng)激素的能力最小，為2.12 μg·mL-1(表4)。

表4 PGPR 菌株分泌IAA能力

2.4 優(yōu)良PGPR固氮能力

利用選擇性培養(yǎng)基NFM和CCM，從萵筍根內(nèi)組織和根表組織分離出20株固氮菌株，觀察菌落形態(tài)特征，菌落顏色以白色和乳白色為主，菌落形狀大部分為規(guī)則圓形且邊緣光滑，根據(jù)菌落形態(tài)特征及生長(zhǎng)速度，初步判斷菌株固氮能力。進(jìn)一步對(duì)其固氮酶活性進(jìn)行測(cè)定，其固氮能力如表5所示。20株菌株固氮酶活性范圍為8.37～371.54 nmol·h-1·ml-1, GNB6固氮酶活性最高，其中固氮酶活性大于100 nmol·h-1·ml-1的菌株共3株，且均分離自萵筍根內(nèi)組織。

表5 優(yōu)良PGPR菌株固氮酶活性

2.5 優(yōu)良PGPR抑制病原菌的能力

通過(guò)研究10株P(guān)GPR對(duì)黃瓜枯萎病(Fusariumoxysporium)、番茄早疫病(Alternariasolani)的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)10株P(guān)GPR對(duì)病原菌的抑制效果差異顯著，其中僅有PGBA2、MGBC3、MGNB4菌株對(duì)黃瓜枯萎病的抑菌率達(dá)到50%以上，且對(duì)番茄早疫病無(wú)抑菌作用(表6)。

表6 PGPR對(duì)病原菌的拮抗效果

2.6 優(yōu)良PGPR菌株的鑒定

綜合評(píng)價(jià)各菌株促生特性，篩選出9株優(yōu)良PGPR，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA鑒定，通過(guò)分子同源序列比對(duì)，確定9株菌中MGBC2、MGBC3、PGBA2為醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，菌株MGNB3、MGNB4為華夏氏腸桿菌(Enterobacterhuaxiensis)，菌株MGBD1為假單胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)，菌株GND5為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，菌株GNA6為氣泡微細(xì)菌(Microbacteriumaerolatum)，菌株GNB6為放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)，并構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。

圖1 代表菌株16SrDNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree constructed by homology of 16SrDNA gene sequence

3 討 論

本研究通過(guò)初篩和復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，溶解有機(jī)磷能力普遍比溶解無(wú)機(jī)磷能力弱，且溶磷圈大小與溶磷能力不完全呈正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果與趙小蓉等[33]，馬驄毓等[34]的研究結(jié)果相一致。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是由于溶磷過(guò)程十分復(fù)雜所導(dǎo)致，微生物溶磷機(jī)制包括質(zhì)子作用、有機(jī)酸作用、或二者共同作用，有些細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中不分泌酸性物質(zhì)，而有些細(xì)菌在代謝過(guò)程中分泌草酸、酒石酸、丙二酸、乳酸和乙酸等有機(jī)酸，部分會(huì)與金屬離子結(jié)合，這部分溶磷能力未被測(cè)定出來(lái)[35]，因此測(cè)定結(jié)果有所偏低；此研究也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)有機(jī)磷培養(yǎng)液pH值偏堿性，而無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)液pH值均偏酸性。其次，分離篩選出的溶解有機(jī)磷菌株溶磷量較小，可能是菌株將難溶性磷一部分轉(zhuǎn)化為中間物質(zhì)，未轉(zhuǎn)化成植物可

直接吸收利用的磷元素，這種中間產(chǎn)物會(huì)被其他微生物分解為植物可直接吸收利用的磷元素，對(duì)植物吸收磷元素起到了間接作用，本實(shí)驗(yàn)方法未將這部分溶磷量檢測(cè)出來(lái)，故測(cè)定的菌株溶磷能力有所降低。

生物固氮為植物生長(zhǎng)提供氮素，在生態(tài)系統(tǒng)中是極為重要的氮來(lái)源之一。甘肅位于我國(guó)西北部，屬于干旱半干旱地區(qū)，土壤貧瘠，固氮微生物對(duì)于提高氮素做出了很大貢獻(xiàn)。本研究分離篩選出固氮菌株固氮酶活性較高的3株為氣泡微細(xì)菌(Microbacteriumaerolatum)、放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，固氮能力(C2H4)達(dá)到371.54 nmol·h-1·ml-1，最低為(C2H4)8.37 nmol·h-1·ml-1，差異極顯著。目前報(bào)道的具有固氮能力的類(lèi)芽孢桿菌有18個(gè)種[36]，這些研究發(fā)現(xiàn)不同種之間的固氮酶活性不同，種的不同菌株之間固氮酶活性也不同[37]，而且這些聯(lián)合固氮菌及自身固氮菌不受宿主范圍的限制，因此以該類(lèi)固氮菌制備的生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。楊鴻儒等[38]在西鄂爾多斯高原荒漠干旱半干旱地區(qū)不同植物上發(fā)現(xiàn)具有高酶活的固氮菌株且該地區(qū)是高酶活固氮作用發(fā)生的重要場(chǎng)所；劉彩霞等[39]在堿性土壤中分離出10株具有固氮功能的細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬。本研究篩選出的20株固氮菌其固氮能力較高的有3株且差異顯著，可能原因是固氮菌株受植物種類(lèi)與土壤性質(zhì)影響[40]。

獲得9株促生特性優(yōu)良菌株，其中醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)3株，是較為常見(jiàn)的促生菌種類(lèi)，主要存在水體和土壤中，其不僅具有溶磷能力，還具有生防能力。齊永志等[41]篩選獲得1株不動(dòng)桿菌B3521，緩解了草莓連作障礙；藺經(jīng)等[42-43]從樟樹(shù)中分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，抑制了梨黑斑病、輪紋病和炭疽病等真菌性病害，起到了較好的防治作用。華夏氏腸桿菌(Enterobacterhuaxiensis)安全性尚不明確，其與Pantoea菌株和生癌腸桿菌(Enterobactercancerogenus)極為相似，且這兩株菌對(duì)人體有害，易引起肺炎，抗藥性強(qiáng)[44]，因此，MGNB4與MGNB3菌株暫且不適宜成為制作微生物接種劑的菌種資源?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)是國(guó)際上認(rèn)可的優(yōu)良根際促生菌，其繁殖能力強(qiáng)、易存活且具有多種促生功能，成為優(yōu)良菌種的可能性極大，后期將對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。本研究篩選出的菌株MGBC3同時(shí)具有抗病和溶磷能力，菌株MGBD1具有分泌植物生長(zhǎng)激素、溶磷能力，且分泌植物生長(zhǎng)激素能力較好，諸如此類(lèi)以1種功能為主，兼具多種功能的PGPR是研究者重點(diǎn)尋找的寶貴資源。張夢(mèng)琦等[45]研究發(fā)現(xiàn)1株多功能根際促生菌DD3，其兼具溶磷、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)HCN等能力，對(duì)大蒜株高、抗病能力等均有所提高。因此，篩選多功能菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義，多功能PGPR是珍貴的生物資源。

4 結(jié) 論

本研究篩選出溶解有機(jī)磷菌株19株，溶解無(wú)機(jī)磷菌株6株，固氮菌株20株，不同PGPR菌株的溶磷能力和固氮能力存在較大差異。菌株溶解無(wú)機(jī)磷的能力普遍高于溶解有機(jī)磷的能力，溶解無(wú)機(jī)磷能力最高為290.66 μg·mL-1，溶解有機(jī)磷能力最高為71.87 μg·mL-1；菌株固氮酶活性(C2H4)最高為371.54 nmol·h-1·mL-1；分泌植物生長(zhǎng)激素IAA菌株14株，菌株MGBD1分泌IAA能力最強(qiáng)，為5.29 μg·mL-1；抑制病原菌菌株3株，且抑菌率均在50%以上。9株優(yōu)良PGPR菌株鑒定為：3株醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，2株華夏氏腸桿菌(Enterobacterhuaxiensis)，1株假單胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)，1株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，1株氣泡微細(xì)菌(Microbacteriumaerolatum)，1株放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)，其可為后續(xù)研制微生物制劑提供菌種資源。