孟司奇，丁高藍(lán)，肖興寧，肖英平，楊 華，汪 雯

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，浙江 杭州 310021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是革蘭氏陽性菌，廣泛分布于牛奶、肉類、蛋類等食物中，是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年，上海市生鮮肉中金黃色葡萄球菌的檢出率為32.9%[2]；我國(guó)生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率則為15%～38%[3]。對(duì)我國(guó)2003—2015年學(xué)校食源性疾病發(fā)生趨勢(shì)的分析表明，金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒人數(shù)排名前5，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了較大威脅[4]。金黃色葡萄球菌腸毒素是一種細(xì)菌外毒素，對(duì)高溫、低pH環(huán)境具有較強(qiáng)耐受性，危害性更大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有50%～75%的金黃色葡萄球菌在合適的條件下能產(chǎn)生腸毒素[5-6]。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)報(bào)告顯示，金黃色葡萄球菌腸毒素已成為世界性的食品安全問題[7]。

巴氏殺菌乳是生乳在低于100 ℃的溫度下處理適當(dāng)時(shí)間殺死部分致病菌制得的液態(tài)乳，與超高溫滅菌乳相比，巴氏殺菌后乳品中的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值保存較好。這是巴氏殺菌乳在國(guó)外乳品市場(chǎng)占有率高的原因之一[8-9]。乳制品在原料收集、加工、儲(chǔ)藏的過程中往往會(huì)受到金黃色葡萄球菌的污染[10]，但是巴氏殺菌的工藝特點(diǎn)決定其并不能殺滅所有微生物，如果儲(chǔ)藏溫度適合，巴氏殺菌乳將成為金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基[11]。據(jù)2017年對(duì)我國(guó)市售巴氏殺菌乳微生物污染的調(diào)查，散裝巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌檢出率為2.65%[12]。研究表明，當(dāng)巴氏殺菌乳中的金黃色葡萄球菌含量達(dá)到105～107CFU·mL-1，即可產(chǎn)生足量的腸毒素造成人體中毒[13]。因此，研究金黃色葡萄球菌在巴氏殺菌乳中的生長(zhǎng)情況對(duì)于保障乳品，乃至食品安全來說都具有積極意義。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)利用數(shù)學(xué)模型定量分析食品中病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)和存活狀況，評(píng)價(jià)環(huán)境因子對(duì)食品質(zhì)量安全的影響，從而對(duì)貨架期做出合理預(yù)測(cè)，旨在提高衛(wèi)生檢驗(yàn)效率，保障食品安全[14-15]。本實(shí)驗(yàn)以巴氏殺菌乳為原料，分別測(cè)定在4、10、16、20、24、28 ℃儲(chǔ)藏條件下金黃色葡萄球菌含量的變化，分別采用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型構(gòu)建恒定溫度下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)一級(jí)模型，另建立二級(jí)模型以描述溫度與最大生長(zhǎng)速率(μmax)的關(guān)系，并通過外部驗(yàn)證方法檢驗(yàn)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：金黃色葡萄球菌菌株(ATCC 25923)；市售巴氏殺菌乳。

試劑：Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、卵黃亞碲酸鉀增菌劑，北京路橋技術(shù)股份有限公司；腦心浸出液(BHI)、緩沖蛋白胨水(BPW)，美國(guó)BD公司；NaCl(分析純)，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KB240恒溫恒濕培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋，日本Hirayama株式會(huì)社；WB04XL螺旋涂布儀，英國(guó)Don Whitley Scientific公司；ProtoCOL P3/1513 菌落計(jì)數(shù)儀，英國(guó)Synbiosis公司；1300 series A2生物安全柜，美國(guó)Thermo公司。

1.3 恒定溫度下金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

1.3.1 菌液制備

取超低溫保存的金黃色葡萄球菌菌株，常溫化凍，使用移液槍吸取0.1 mL添加到5 mL含7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的BHI中，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌株復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌株充分搖勻，得到菌含量約為108CFU·mL-1的菌懸液，用BPW稀釋到105CFU·mL-1備用。

1.3.2 金黃色葡萄球菌的接種、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

在巴氏殺菌乳中添加菌懸液，制備菌含量約為103CFU·mL-1的初始污染試樣。將試樣充分搖勻后，分別放置在4、10、16、20、24、28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)不同溫度下的生長(zhǎng)速率設(shè)定相應(yīng)的取樣時(shí)間，將取出的樣品用BPW進(jìn)行適當(dāng)稀釋，利用螺旋涂布儀進(jìn)行平板涂布，放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用平板計(jì)數(shù)儀對(duì)菌量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 一級(jí)模型擬合

一級(jí)模型主要描述微生物數(shù)量與時(shí)間的關(guān)系。本研究利用OriginPro 9.0軟件，分別采用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型進(jìn)行巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌在恒定溫度下的生長(zhǎng)曲線擬合[16-19]，建立特定溫度下金黃色葡萄球菌隨時(shí)間變化的一級(jí)生長(zhǎng)模型，獲得相對(duì)最大生長(zhǎng)速率(μmax)。

Modified Gompertz模型方程為

(1)

Huang模型方程為

lgNt=lgN0+lgNmax-lg{exp(lgN0)+[exp(lgNmax)-exp(lgN0)]*exp[-μmax*(B)]}，

(2)

(3)

式(1)～(3)中：Nt為t時(shí)刻的菌落數(shù)(CFU·mL-1)，N0為初始菌落數(shù)(CFU·mL-1)，Nmax為最大菌落數(shù)(CFU·mL-1)，μmax為相對(duì)最大生長(zhǎng)速率(h-1)，λ為菌生長(zhǎng)遲滯期(h)。

Logistic模型方程為

(4)

式(4)中：t0為細(xì)菌生長(zhǎng)速率最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間(h)，p為t0時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)速率(斜率，h-1)。

Baranyi模型方程為

(5)

(6)

式(6)中h0為微生物初始生理狀態(tài)。

1.3.4 二級(jí)模型擬合

引入二級(jí)模型描述溫度對(duì)初級(jí)模型參數(shù)的影響。本研究采用平方根模型和Arrhenius模型擬合溫度-相對(duì)最大生長(zhǎng)速率(μmax)曲線[20-21]。

平方根模型方程為

(7)

式(7)中：b為系數(shù)；T為培養(yǎng)溫度(℃)；Tmin為最低生長(zhǎng)溫度(℃)，指微生物沒有代謝活動(dòng)時(shí)的溫度，是通過外推回歸線與溫度軸相交而得到的溫度。

Arrhenius模型方程為

(8)

式(8)中：a為頻率因子；T為溫度(℃)；R為氣體常數(shù)，8.314 J·mol-1·℃-1；ΔG′為吉布斯自由能(J·mol-1)；n為指數(shù)系數(shù)。

1.3.5 模型的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證

利用決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和赤池信息準(zhǔn)則數(shù)值(AIC，衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn)，值越小越好)評(píng)價(jià)一級(jí)模型的擬合程度；利用R2、RMSE評(píng)價(jià)二級(jí)模型，并采用準(zhǔn)確因子(Af)和偏差因子(Bf)驗(yàn)證準(zhǔn)確度。

Af和Bf是驗(yàn)證模型可靠度的有效工具[22]。Af可以衡量預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值的接近程度。一般認(rèn)為，Af值越接近于1，表明模型平均精確度越高，Af值介于1.1～1.9的模型也可接受[23-24]。Bf可以衡量預(yù)測(cè)值的偏離程度。一般認(rèn)為，Bf值越接近于1越可靠，在0.90～1.05的表現(xiàn)良好，在0.70～0.90或1.05～1.15的也可接受[25-26]。本研究采用ComBase模型[27]和文獻(xiàn)[28-32]中金黃色葡萄球菌在巴氏殺菌乳或生鮮乳等原料中的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行外部驗(yàn)證，計(jì)算Af和Bf。

(9)

(10)

式(9)、(10)中：pre為預(yù)測(cè)值，obs為實(shí)測(cè)值，n為測(cè)量值個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 一級(jí)模型建立

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和圖1可知，4 ℃下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值在0～216 h下降了0.2個(gè)單位[lg(CFU·mL-1)]，金黃色葡萄球菌處于緩慢失活的過程。采用OriginPro 9.0軟件，分別利用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型對(duì)10、16、20、24、28 ℃下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合(圖2)，并由此得到相應(yīng)的模型參數(shù)(表1～4)。由表1可知，各溫度下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值均隨時(shí)間推進(jìn)而呈上升趨勢(shì)，并且隨著溫度升高，相對(duì)最大生長(zhǎng)速率(μmax)不斷升高，遲滯期(λ)不斷下降，說明金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)狀況與溫度密切相關(guān)。

圖1 巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌在4 ℃的衰亡趨勢(shì)Fig.1 Survival trend of S. aureus in pasteurized milk at 4 ℃

由表1～4可知，10～28 ℃下4種模型的決定系數(shù)(R2)均大于0.97；Huang模型與其他3種模型相比，AIC值較高，且在16 ℃下R2較低(0.97)；Logistic模型的p值與Baranyi模型的μmax值均在16 ℃最高，然后隨溫度升高呈下降趨勢(shì)，與實(shí)際情況不符，只有Modified Gompertz模型的μmax值與溫度呈正相關(guān)關(guān)系。綜上，本研究選用Modified Gompertz模型為最終的一級(jí)模型。

表1 Modified Gompertz模型擬合得到的生長(zhǎng)參數(shù)和擬合參數(shù)

2.2 二級(jí)模型建立

一級(jí)模型主要描述微生物數(shù)量與時(shí)間的定量關(guān)系，無法表達(dá)環(huán)境因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。本研究主要考慮溫度對(duì)生長(zhǎng)參數(shù)的作用，利用平方根模型和Arrhenius模型作為二級(jí)模型，根據(jù)Modified Gompertz模型擬合得到的巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌在不同溫度下生長(zhǎng)的μmax，采用OriginPro 9.0軟件對(duì)溫度與μmax的關(guān)系進(jìn)行擬合(圖3)。

表2 Huang模型擬合得到的生長(zhǎng)參數(shù)和擬合參數(shù)

表3 Logistic模型擬合得到的生長(zhǎng)參數(shù)和擬合參數(shù)

表4 Baranyi模型擬合得到的生長(zhǎng)參數(shù)和擬合參數(shù)

由圖3可見，Arrhenius模型的R2為0.99，而平方根模型的R2為0.90，說明Arrhenius模型的擬合度更高；因此Arrhenius模型較平方根模型能更好地描述本研究中10～28 ℃范圍內(nèi)巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌相對(duì)最大生長(zhǎng)速率與溫度的關(guān)系。

圖3 Arrhenius模型(A)和平方根模型(B)擬合的μmax與生長(zhǎng)溫度的關(guān)系曲線Fig.3 Fitted relationship of maximum growth rates of S .aureus with temperatures by Arrhenius model (A) and square root model (B)，respectively

2.3 模型評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

預(yù)測(cè)模型構(gòu)建后，不僅要對(duì)其擬合度進(jìn)行評(píng)估，還要在應(yīng)用之前經(jīng)過驗(yàn)證來對(duì)模型的可靠性做出評(píng)價(jià)。本研究利用外部驗(yàn)證對(duì)建立的二級(jí)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

由表5可知，相較于平方根模型，Arrhenius模型的R2(0.99)更高，RMSE值(0.60)更低，說明Arrhenius模型的擬合程度高，離散程度低。Arrhenius模型的Af值為1.39，Bf值為0.87；平方根模型的Af值為1.57，Bf值為0.83。兩種模型的Af值和Bf值均在合理范圍內(nèi)，但前者更接近于1。綜上，Arrhenius模型的預(yù)測(cè)效果更好。

表5 二級(jí)模型的Af、Bf、RMSE和R2

在本研究檢索范圍內(nèi)，關(guān)于巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的文獻(xiàn)研究較少，所以本研究結(jié)合了金黃色葡萄球菌在生鮮乳、滅菌乳等產(chǎn)品中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型的外部驗(yàn)證，不同來源的數(shù)據(jù)偏差較大，致使Af值偏大，但也體現(xiàn)了模型的普適性。

3 討論

預(yù)測(cè)微生物學(xué)通過數(shù)學(xué)模型對(duì)特定環(huán)境下微生物的數(shù)量變化進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前，已有許多學(xué)者就乳品中微生物的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行了研究。魏釗異等[33]利用Ratkowsky平方根模型描述了溫度對(duì)巴氏殺菌乳中微生物菌群生長(zhǎng)的影響，所建模型能有效預(yù)測(cè)菌落總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化；趙鑫等[34]將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與Gompertz模型相比較，建立了以溫度為自變量的平方根模型；Fujikawa等[35]構(gòu)建了14.0～36.5 ℃下金黃色葡萄球菌在滅菌乳中的生長(zhǎng)模型和產(chǎn)腸毒素模型，認(rèn)為腸毒素產(chǎn)生速率與溫度呈線性關(guān)系，為控制滅菌乳中的金黃色葡萄球菌及其腸毒素供了科學(xué)數(shù)據(jù)，但因?yàn)榘褪蠚⒕楠?dú)特的工藝，導(dǎo)致基于滅菌乳建立的模型在巴氏殺菌乳中適用性并不高。本文描述了巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)規(guī)律，可以為巴氏殺菌乳的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供幫助。

現(xiàn)有的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通常使用105CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌作為產(chǎn)生足量腸毒素并導(dǎo)致食物中毒的閾值[36]。當(dāng)巴氏殺菌乳中的金黃色葡萄球菌的初始含量為103CFU·mL-1時(shí)，在10 ℃下約需130 h其含量即可達(dá)到105CFU·mL-1，在16 ℃下這一過程約需28 h，而在20、24、28 ℃下則僅需17～19 h。所以，當(dāng)儲(chǔ)藏溫度為28 ℃時(shí)，雖然20 h以內(nèi)巴氏殺菌乳的感官品質(zhì)不會(huì)發(fā)生明顯變化，但是卻會(huì)給人體健康埋下較大隱患。因此，在巴氏殺菌乳的運(yùn)輸、銷售和存儲(chǔ)過程中，均應(yīng)嚴(yán)格控制存放溫度和時(shí)間。

多項(xiàng)研究報(bào)道，金黃色葡萄球菌腸毒素的產(chǎn)生除了受金黃色葡萄球菌濃度的影響外，還受到外部環(huán)境和自身的綜合影響。這就導(dǎo)致學(xué)界一直以來都未能建立準(zhǔn)確的劑量-反應(yīng)模型。因此，目前基于金黃色葡萄球菌數(shù)量進(jìn)行的安全性評(píng)價(jià)仍具有一定的局限性[37-38]。未來，可在巴氏殺菌乳中結(jié)合更多環(huán)境因素的影響建立金黃色葡萄球菌和腸毒素預(yù)測(cè)模型，確立二者的定量關(guān)系，為巴氏殺菌乳的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供全面、高效的信息。

綜上，本文研究了4～28 ℃范圍內(nèi)金黃色葡萄球菌在巴氏殺菌乳中的生長(zhǎng)規(guī)律，建立了巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的一級(jí)模型和二級(jí)模型。綜合比較了4種一級(jí)模型的效果，發(fā)現(xiàn)Modified Gompertz模型在不同溫度下擬合度均較好，是描述巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)規(guī)律的最適一級(jí)模型。對(duì)比平方根模型，Arrhenius模型的R2和RMSE值分別為0.99和0.60，可作為二級(jí)模型擬合相對(duì)最大生長(zhǎng)速率與溫度間的關(guān)系。外部驗(yàn)證結(jié)果表明，Af值和Bf值均在可接受范圍內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的二級(jí)模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)狀況，模型具有可靠性。本研究可為巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的安全性評(píng)價(jià)、乳品貨架安全期預(yù)測(cè)，以及乳品乃至食品中致病微生物的定量研究提供依據(jù)。