張 亮，李玉婷，許曉風(fēng)，2，*

(1.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

錳元素廣泛分布于礦石和硅酸鹽巖石中。土壤中錳含量在10～9 478 mg·kg-1變化，我國(guó)土壤錳含量總體表現(xiàn)為南高北低[1]。目前，南方部分地區(qū)受酸雨影響，土壤中鋁、錳大量溶出，加上電子工業(yè)、機(jī)械制造等產(chǎn)業(yè)排放，以及一些錳礦和有色金屬礦的粗放式開采，土壤錳污染非常嚴(yán)重[2]。微量的錳元素可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但是土壤中過量的錳元素將會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，同時(shí)阻礙植物對(duì)其他礦質(zhì)元素，如磷、鉀、鎂等的吸收[3-4]。在我國(guó)南方的一些森林植被系統(tǒng)，山高坡陡，土壤貧瘠，加上土壤酸化，給本來就很脆弱的森林生態(tài)系統(tǒng)帶來了更多的不穩(wěn)定性，大面積的森林植被退化。對(duì)錳污染土壤的治理和修復(fù)已刻不容緩。

在錳污染土壤上植樹造林是有效的治理途徑之一。在森林土壤中，多種樹木的根系可以與外生菌根真菌形成共生體，既能提高植物對(duì)重金屬錳的拮抗能力，同時(shí)有助于植物根系對(duì)土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，從而有效緩解森林植被退化[5-6]。植物-真菌共生體具有活化土壤難溶性磷、鉀和拮抗重金屬的能力，一般認(rèn)為，主要是共生真菌在植物根系表面形成的菌絲套和外延菌絲在起作用[7-8]。有研究表明，在受到重金屬污染的礦區(qū)，外生菌根真菌菌絲中的相應(yīng)重金屬含量也會(huì)很高，但這些菌株卻能一直生存下去，并表現(xiàn)出極高的侵染能力，這說明外生菌根真菌能夠緩解重金屬的危害[9-10]。一方面，外生菌根真菌與植物形成共生體之后，會(huì)產(chǎn)生菌絲套，從而減少或避免錳離子的危害[11]；另一方面，外生菌根真菌能夠產(chǎn)生多種有機(jī)酸，包括草酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、乳酸等，特別是草酸能與錳離子結(jié)合成穩(wěn)定的絡(luò)合物，限制錳離子通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[12-13]。此外，這些有機(jī)酸還能夠直接作用于云母、鉀長(zhǎng)石、花崗巖等含鉀礦物，使鉀離子溶出，供森林樹木吸收利用[14-15]。目前，涉及外生菌根真菌的研究多關(guān)注于菌根化苗木的培育方面，關(guān)于錳離子污染脅迫環(huán)境下外生菌根真菌活化土壤難溶性礦質(zhì)元素的研究在檢索范圍內(nèi)還未見報(bào)道。本研究選取南方森林酸性黃紅壤作為供試土壤，研究外生菌根真菌在錳離子脅迫下活化土壤難溶性鉀的能力及其作用機(jī)制，以期為錳污染土壤的治理和森林植被的恢復(fù)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

試驗(yàn)選擇彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius，Pt)和松乳菇(Lactariusdeliciosus，Ld)2種外生菌根真菌作為供試菌種，將2株供試菌種接種到去除鉀源的Pachlewsk固體培養(yǎng)基(磷酸二氫鈉代替磷酸二氫鉀)[16]中，活化14 d備用。

1.1.2 土壤

供試土壤系采自浙江安吉藏龍百瀑景區(qū)馬尾松林下的底層土壤，屬發(fā)育于砂巖的酸性黃紅壤。將土壤自然風(fēng)干后，去除石子、雜草等，過篩(100目)，稱取1.000 g土壤裝入兩端用玻璃纖維和濾膜(孔徑0.22 μm)封口的PVC管(直徑1 cm、長(zhǎng)度2 cm)中，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，30 min)后備用。土壤理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)20.5 g·kg-1，全氮1.07 g·kg-1，全鉀9.55 g·kg-1，pH值4.25，有效鉀82.2 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

我國(guó)南方錳礦區(qū)周圍土壤溶液中錳離子含量介于157.1～824.5 mg·L-1[17]，因此，本試驗(yàn)配置錳離子質(zhì)量濃度分別為0、100、200、400、800 mg·L-1的缺鉀Pachlewsk液體培養(yǎng)基，將pH調(diào)至4.25。取20 mL的液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，加入裝有1.000 g土壤的PVC管一個(gè)，包扎封口，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，30 min)，在超凈工作臺(tái)中接種1塊按1.1.1節(jié)描述活化好的固體菌塊(直徑為6 mm)，另以不接種真菌、錳離子質(zhì)量濃度為0的處理作為對(duì)照(CK)。以上各處理均重復(fù)5次。接種后25 ℃培養(yǎng)14 d，備測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

培養(yǎng)14 d后，過濾培養(yǎng)液，收集濾液和菌絲，用PHSJ-4A型酸度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)測(cè)定濾液pH。菌絲烘干(105 ℃)后稱重，測(cè)定生物量。干菌絲經(jīng)濃硫酸-過氧化氫濕法消煮后用火焰光度法測(cè)定鉀含量[18]。取出PVC管中的土壤，自然風(fēng)干，分別用蒸餾水、醋酸銨(1 mol·L-1)和沸硝酸(1 mol·L-1)提取土壤中的水溶性鉀、交換性鉀和緩效鉀，在上述溶液提取后的土壤中加入氫氧化鈉固體，置于馬弗爐中熔融(450 ℃)，得到礦物結(jié)構(gòu)鉀，最后采用火焰光度法測(cè)定鉀含量[19]。

采用1260型高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)測(cè)定濾液中草酸、蘋果酸、乙酸和檸檬酸含量，標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純。色譜條件如下：Hi-Plex H有機(jī)酸分析柱(300 mm×7.7 mm，8 μm)，流動(dòng)相為水(稀硫酸調(diào)節(jié)pH至2.5)，流速為0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為60 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行基本計(jì)算和繪圖，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和皮爾遜(Pearson)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳離子對(duì)外生菌根真菌生物量、鉀含量和鉀吸收量的影響

2.1.1 錳離子對(duì)菌絲生物量的影響

在錳離子質(zhì)量濃度逐漸升高的過程中，2株外生菌根真菌的生物量逐漸減低(表1)，生長(zhǎng)受到顯著(P<0.05)抑制。其中，Pt在錳離子質(zhì)量濃度為800 mg·L-1時(shí)的生物量較錳離子質(zhì)量濃度為0時(shí)降低了45.50%，Ld在錳離子質(zhì)量濃度為800 mg·L-1時(shí)的生物量較錳離子質(zhì)量濃度為0時(shí)降低了56.28%。在相同質(zhì)量濃度的錳離子脅迫下，Pt的生物量均大于Ld，說明錳離子對(duì)Pt生長(zhǎng)的抑制作用要弱于Ld。

2.1.2 錳離子對(duì)菌絲中鉀含量、鉀吸收量的影響

由表1可知，在缺鉀的培養(yǎng)基中，2株外生菌根真菌都能從土壤中吸收鉀元素供自身生長(zhǎng)需要。錳離子脅迫下，2株外生菌根真菌吸收鉀的能力存在差異。當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度逐漸升高時(shí)，2株外生菌根真菌的鉀含量和鉀吸收量均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，且均在錳離子質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值。

表1 錳離子對(duì)外生菌根真菌生長(zhǎng)和鉀吸收的影響

2.2 液體培養(yǎng)基中pH變化

2株外生菌根真菌在培養(yǎng)14 d后，液體培養(yǎng)基的pH值均隨錳離子質(zhì)量濃度升高而顯著(P<0.05)降低(圖1)。當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度為800 mg·L-1時(shí)，Pt和Ld所在液體培養(yǎng)基的pH值分別較CK下降1.23、1.19個(gè)單位。在相同質(zhì)量濃度的錳離子脅迫下，2株外生菌根真菌的培養(yǎng)基pH值相差不大。

2.3 錳離子對(duì)外生菌根真菌釋放有機(jī)酸的影響

如表2所示，相同錳離子質(zhì)量濃度下，Pt的草酸、乙酸分泌量高于Ld。Pt的草酸、乙酸分泌量分別在錳離子質(zhì)量濃度為200、400 mg·L-1時(shí)最高，Ld的草酸、乙酸分泌量分別在錳離子質(zhì)量濃度為400、800 mg·L-1時(shí)最高。此外，在外生菌根真菌Ld處理的溶液中還檢測(cè)到蘋果酸和檸檬酸。

表2 液體培養(yǎng)基中真菌釋放有機(jī)酸的質(zhì)量濃度

2.4 錳離子脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤不同形態(tài)鉀含量的影響

由表3可知，接種外生菌根真菌后土壤交換性鉀、緩效鉀和礦物結(jié)構(gòu)鉀較CK顯著(P<0.05)變化，但在部分錳離子質(zhì)量濃度條件下土壤中水溶性鉀含量變化不顯著。與CK相比，各錳離子質(zhì)量濃度下土壤中難溶性的礦物結(jié)構(gòu)鉀含量均顯著(P<0.05)降低，同時(shí)土壤中的交換性鉀和緩效鉀含量均顯著(P<0.05)提高。當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)，2株外生菌根真菌分解礦物結(jié)構(gòu)鉀的能力最強(qiáng)，分解率分別達(dá)到4.16%(Pt)和2.58%(Ld)，土壤中緩效鉀含量增加最多，分別比CK增加了16.17%(Pt)和11.30%(Ld)。當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度分別為400、800 mg·L-1時(shí)，接種Pt、Ld的土壤中交換性鉀含量增加最多，分別比對(duì)照提高了20.34%和17.78%。以上結(jié)果說明，在錳離子脅迫下，外生菌根真菌能活化土壤中的難溶性鉀用于補(bǔ)充緩效鉀和交換性鉀，菌株P(guān)t分解土壤難溶性鉀的能力強(qiáng)于Ld。

CK中不引入真菌菌株。同一菌株各柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。There was no strain in CK. Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 for the same strain. The same as below.圖1 真菌生長(zhǎng)對(duì)液體培養(yǎng)基pH的影響Fig.1 Effects of fungus growth on pH of liquid culture medium

土壤中的水溶性鉀和交換性鉀合起來即為土壤有效鉀。由表3可知，土壤有效鉀含量因培養(yǎng)基中錳離子質(zhì)量濃度和菌株不同而異。與CK相比，2株外生菌根真菌均能提高土壤有效鉀含量，當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度分別為400、800 mg·L-1時(shí)，接種Pt、Ld的土壤有效鉀含量增加最多，分別增加了19.76%和17.23%。菌株P(guān)t提高土壤鉀有效性的能力強(qiáng)于Ld。

表3 土壤中不同形態(tài)鉀素含量

2.5 各因素的相關(guān)分析

由表4可知：培養(yǎng)液中pH與土壤中交換性鉀含量呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)，與土壤水溶性鉀含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)；草酸含量與土壤交換性鉀含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與緩效鉀含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與礦物結(jié)構(gòu)鉀含量呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)。此外，土壤水溶性鉀含量與交換性鉀含量呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)，交換性鉀含量與緩效鉀含量呈顯著(P<0.05)正相關(guān)，緩效鉀含量與礦物結(jié)構(gòu)鉀含量呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說明，外生菌根真菌分泌的草酸和培養(yǎng)液中pH的降低有利于土壤中礦物結(jié)構(gòu)鉀的分解，分解的難溶性鉀可以用來補(bǔ)充緩效鉀和交換性鉀。

表4 試驗(yàn)各因素的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論與討論

外生菌根真菌與樹木根系形成共生體后，有益于植物抵抗不良環(huán)境[20]。在重金屬影響下，真菌菌絲的生長(zhǎng)情況能直接反映其抵御不良環(huán)境的能力[21-22]。在本研究中，2株外生菌根真菌對(duì)錳離子的敏感度不同，在相同質(zhì)量濃度的錳離子下，Pt的菌絲生物量均大于Ld，說明Ld對(duì)錳離子比較敏感，抗性較差，而Pt對(duì)錳的抗性較強(qiáng)，在較高質(zhì)量濃度的錳離子脅迫下也能很好地生長(zhǎng)。研究表明，菌株P(guān)t對(duì)其他金屬，如鋁、鎘、汞等亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性[23-24]。在較低的錳離子質(zhì)量濃度下(0～200 mg·L-1)，菌絲鉀吸收量逐漸升高，但當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度在400～800 mg·L-1時(shí)，外生菌根真菌菌絲中的鉀含量逐漸降低。這說明低質(zhì)量濃度的錳離子能促進(jìn)外生菌根真菌從周圍低鉀的環(huán)境中吸收鉀元素，然而當(dāng)錳離子的質(zhì)量濃度超過一定范圍時(shí)，將不利于真菌從環(huán)境中吸收礦質(zhì)元素。

土壤中的鉀主要呈無機(jī)態(tài)，其中礦物結(jié)構(gòu)鉀占90%～98%，緩效鉀約占2%，有效鉀僅有1%～2%(包括水溶性鉀和交換性鉀)。土壤中的多種微生物能活化利用鉀長(zhǎng)石、云母、伊利石中的鉀元素[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在錳離子脅迫下，接種的外生菌根真菌可以分解土壤中的礦物結(jié)構(gòu)鉀，但不同菌株的分解能力存在差異。當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)，2株外生菌根真菌分解礦物結(jié)構(gòu)鉀的能力最強(qiáng)，分解率分別達(dá)到了4.16%(Pt)和2.58%(Ld)。同時(shí)，2株外生菌根真菌都能增加土壤中的緩效鉀和交換性鉀。這說明，在錳離子脅迫下，外生菌根真菌能活化土壤中的難溶性鉀，分解的難溶性鉀可用于補(bǔ)充緩效鉀和交換性鉀。

外生菌根真菌侵染植物后，可以促使宿主植物根系向土壤中釋放氫離子，進(jìn)入2∶1型非膨脹性含鉀礦物晶層中，替換其中的鉀離子，從而提高鉀元素的有效性，滿足植物對(duì)礦質(zhì)元素的需求[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的pH隨著錳離子質(zhì)量濃度升高而逐漸下降，其中菌株P(guān)t在錳離子質(zhì)量濃度為800 mg·L-1時(shí)下降最多，與CK相比下降1.23個(gè)單位(即其培養(yǎng)基中的氫離子濃度是對(duì)照組的17倍)，而且培養(yǎng)液中pH與土壤中交換性鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明外生菌根菌可以通過氫離子的分泌，從土壤礦物中獲得鉀離子，并提高土壤有效鉀的含量。外生菌根真菌在低鉀的環(huán)境中，能向周圍分泌草酸、甲酸、檸檬酸和丁二酸等有機(jī)酸，其中以草酸分泌量最大[29]。在體外純培養(yǎng)條件下，外生菌根真菌活化鐵礦石中的磷、鉀元素主要依靠菌絲產(chǎn)生的有機(jī)酸，菌絲與礦物的物理接觸可能在鐵礦石的風(fēng)化過程中也起到關(guān)鍵的作用[30]。利用草酸、酒石酸、檸檬酸等有機(jī)酸對(duì)黑云母、白云母和微斜長(zhǎng)石進(jìn)行溶鉀能力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草酸提取礦石中鉀的能力最強(qiáng)[31]。草酸對(duì)難溶性礦物中的鈣、鋁、鐵等金屬有較強(qiáng)的絡(luò)合能力，同時(shí)又能電離出氫離子，通過酸解作用活化礦物中的鉀元素[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)t能分泌草酸和乙酸，Ld能分泌草酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸，其中草酸分泌量最高(Pt為95.26 mg·L-1，Ld為72.14 mg·L-1)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中的草酸分泌量與土壤交換性鉀、緩效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與土壤礦物結(jié)構(gòu)鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，土壤緩效鉀與礦物結(jié)構(gòu)鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。筆者推測(cè)，外生菌根真菌分泌的草酸在活化土壤礦物結(jié)構(gòu)鉀的過程中起到關(guān)鍵作用。草酸分泌能力的差異，可能是導(dǎo)致2株外生菌根真菌活化土壤難溶性鉀的能力不同的原因之一。

在我國(guó)南方大部分地區(qū)，土壤中錳離子的有效性受酸雨影響逐漸提高，加上森林土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)貧瘠，導(dǎo)致樹木根系周圍有益微生物生長(zhǎng)受限，進(jìn)而影響到根系對(duì)磷、鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素的吸收。本研究中，菌株P(guān)t和Ld對(duì)錳的抗性強(qiáng)弱有差異，同時(shí)，二者活化土壤難溶性鉀的能力也存在差異，研究結(jié)果可為篩選合適的菌株來侵染苗木進(jìn)行造林提供科學(xué)參考。