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子宮內(nèi)膜癌組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)情況及與患者免疫功能和微衛(wèi)星不穩(wěn)定的關(guān)系

2020-07-28 07:30于文亮潘長(zhǎng)清鄭茜文
癌癥進(jìn)展 2020年12期
關(guān)鍵詞:腺癌內(nèi)膜子宮

于文亮,潘長(zhǎng)清,鄭茜文

綿陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川 綿陽(yáng) 621000

子宮內(nèi)膜癌是一類(lèi)常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,研究顯示其發(fā)病率居全部婦科惡性腫瘤的首位[1-2]。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示,2015年中國(guó)子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例超過(guò)6萬(wàn)例,發(fā)病率僅次于宮頸癌[3]。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展所處的內(nèi)外環(huán)境,其在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中均具有重要意義[4-6]。腫瘤微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞,尤其是T淋巴細(xì)胞,對(duì)患者預(yù)后具有重要意義。影響腫瘤微環(huán)境淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平的因素十分復(fù)雜,臨床上認(rèn)為新抗原的產(chǎn)生可能是其機(jī)制之一,而錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)蛋白與新抗原的產(chǎn)生密切相關(guān)[7]。有研究表明,存在MMR蛋白缺失的結(jié)直腸癌組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著高于MMR蛋白表達(dá)的結(jié)直腸癌組織[8],但目前尚無(wú)研究報(bào)道在子宮內(nèi)膜癌中是否存在相似的現(xiàn)象。自1981年首次提出微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)的概念后,大量研究者關(guān)注其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,并探討其與MMR蛋白表達(dá)的相關(guān)性,但目前關(guān)于其與子宮內(nèi)膜癌的研究報(bào)道較少?;诖?,本研究通過(guò)分析子宮內(nèi)膜癌中常見(jiàn)的4種MMR蛋白(PMS2、MLH1、MSH2、MSH6)的表達(dá)情況,并探討MMR蛋白表達(dá)情況與患者免疫功能及MSI的關(guān)系,旨在為臨床上評(píng)價(jià)患者預(yù)后提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011年3月至2018年3月于綿陽(yáng)市中心醫(yī)院確診的82例子宮內(nèi)膜癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理檢查診斷為子宮內(nèi)膜癌;②在確診前半年內(nèi)未接受過(guò)相應(yīng)的腫瘤治療或激素治療;③未合并其他嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾?。虎谝缽男圆?;③既往有子宮或?qū)m頸手術(shù)史。82例患者的年齡為31~59歲,平均年齡為(43.8±5.4)歲;非子宮內(nèi)膜腺癌8例(漿細(xì)胞癌5例,透明細(xì)胞癌3例),子宮內(nèi)膜腺癌74例;國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,F(xiàn)IGO)分期:Ⅰ期55例,Ⅱ期13例,Ⅲ期12例,Ⅳ期2例。采集患者的病理組織制成石蠟標(biāo)本,并分為2份,一份用于免疫組織化學(xué)染色,另一份用于提取DNA并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),同時(shí)采集患者的正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 將組織蠟塊連續(xù)切取3~5 μm厚切片,采用免疫組化Envision二步法進(jìn)行檢測(cè)。切片通過(guò)脫水和水化后,進(jìn)行熱修復(fù),然后加入3%H2O2溶液避光孵育20 min。采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)清洗3次,每次5 min。加入一抗溶液(MLH1抗體稀釋度為1∶50,MSH2抗體稀釋度為1∶200,MSH6抗體稀釋度為1∶150,PMS2 抗體稀釋度為1∶50,CD4+抗體稀釋度為 1∶200,CD8+抗體稀釋度為 1∶150),置于4℃冰箱中避光孵育過(guò)夜。PBS清洗3次,每次5 min,加入生物素標(biāo)記的二抗,37℃避光孵育30 min。PBS清洗3次,每次5 min。通過(guò)現(xiàn)配的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)溶液進(jìn)行顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹(shù)膠封片,于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察??贵w均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。采用已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照,PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 PCR 提取腫瘤組織DNA,檢測(cè)5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,引物序列購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限責(zé)任公司(表1)。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性15 min;94℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,共32個(gè)循環(huán);72℃延伸25 min。4℃保存。將擴(kuò)增后的微衛(wèi)星片段經(jīng)95℃變性5 min后進(jìn)行毛細(xì)管電泳,采用Gene Mapper4.1對(duì)微衛(wèi)星片段進(jìn)行分析。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 MMR蛋白表達(dá)缺失判定 MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達(dá)定位于細(xì)胞核,黃色或棕褐色為陽(yáng)性,陰性即為表達(dá)缺失。判讀結(jié)果時(shí),應(yīng)注意內(nèi)對(duì)照的選擇,非腫瘤性的內(nèi)膜間質(zhì)、腺體及淋巴細(xì)胞核應(yīng)棕黃色陽(yáng)性著色。只有在內(nèi)對(duì)照陽(yáng)性背景下的腫瘤細(xì)胞核的表達(dá)完全缺失才能認(rèn)為有效,此外還應(yīng)注意對(duì)腫瘤組織區(qū)域進(jìn)行評(píng)估,而不應(yīng)選擇非腫瘤區(qū)域如增殖癥區(qū)域[9-10]。

表1 MSI位點(diǎn)的引物序列

1.3.2 T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況 CD4+和CD8+的表達(dá)定位于淋巴細(xì)胞膜,棕黃色為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)檢閱至少5個(gè)高倍鏡(×400)視野,每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。取5個(gè)區(qū)域淋巴細(xì)胞數(shù)平均值。

1.3.3 MSI 陽(yáng)性判定 腫瘤組織和同一患者的正常組織DNA在同一條件下電泳,若出現(xiàn)完全一致的電泳條帶,則為MSI陰性,若出現(xiàn)條帶的移動(dòng)、缺失或額外條帶,則為MSI陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR 蛋白表達(dá)缺失情況

82例子宮內(nèi)膜癌患者中,PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表達(dá)缺失例數(shù)分別為8例、7例、6例和13例,蛋白表達(dá)缺失率分別為9.8%、8.5%、7.3%、15.9%??偟鞍妆磉_(dá)缺失率為35.4%(29/82),其中單個(gè)蛋白缺失24例,2個(gè)蛋白聯(lián)合缺失5例(3例MLH1/PMS2蛋白缺失,2例MSH2/MSH6蛋白缺失)。

2.2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失情況的比較

不同F(xiàn)IGO分期、浸潤(rùn)深度子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。年齡>50歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率分別明顯高于年齡≤50歲、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。子宮內(nèi)膜腺癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于非子宮內(nèi)膜腺癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(表2)

表2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失情況的比較(n=82)

2.3 MMR 蛋白表達(dá)缺失和未缺失子宮內(nèi)膜癌患者中CD4+及CD8+水平的比較

MMR蛋白表達(dá)缺失患者的CD4+水平為(74.27±10.26)%,明顯高于MMR蛋白表達(dá)未缺失患者的(35.91±8.42)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.237,P<0.01);MMR蛋白表達(dá)缺失患者的CD8+水平為(70.31±6.32)%,明顯高于MMR蛋白表達(dá)未缺失患者的(35.28±10.97)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.341,P<0.01)。

2.4 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MSI發(fā)生情況的比較

82例患者中,MSI陽(yáng)性17例,陽(yáng)性率為20.73%。年齡>50歲子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽(yáng)性率高于年齡≤50歲的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽(yáng)性率高于非子宮內(nèi)膜腺癌患者,低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽(yáng)性率低于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同F(xiàn)IGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽(yáng)性率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表3)

2.5 MSI與MMR 蛋白表達(dá)的關(guān)系

17例MSI陽(yáng)性患者中,MMR蛋白表達(dá)缺失15例,缺失率為88.24%,65例MSI陰性患者中,MMR蛋白表達(dá)缺失14例,缺失率為21.54%。MSI陽(yáng)性患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于MSI陰性患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.225,P<0.01)。

表3 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MSI情況的比較(n=82)

3 討論

MMR基因具有保守性,而這一特性在基因組的穩(wěn)定性以及DNA復(fù)制的忠誠(chéng)性中具有重要意義。突變的MMR蛋白可能會(huì)增加腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),其可能的機(jī)制為突變導(dǎo)致MSI或錯(cuò)誤復(fù)制引起基因組不穩(wěn)定,進(jìn)而促進(jìn)癌基因與抑癌基因異常表達(dá),最終導(dǎo)致某些細(xì)胞的無(wú)序及無(wú)限制增殖[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中MMR基因突變率較高,其可能的原因?yàn)楫?dāng)MMR基因發(fā)生突變時(shí),MMR蛋白表達(dá)過(guò)低或缺失,造成MMR修復(fù)功能障礙,而由于機(jī)體難以及時(shí)修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中的異常,從而導(dǎo)致“滑鏈錯(cuò)配”、復(fù)制差錯(cuò)、染色體互換不均勻等的發(fā)生,造成微衛(wèi)星DNA的長(zhǎng)度改變,引發(fā)MSI,最終對(duì)細(xì)胞的正常增殖造成一定影響,為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有利環(huán)境,同時(shí)癌基因和抑癌基因異常表達(dá)也會(huì)誘發(fā)腫瘤組織的形成[13-14]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,具有MMR基因突變的女性子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為40%~60%,而在正常人群中,這一比例僅約2.3%[15]。子宮內(nèi)膜癌組織中不同MMR蛋白表達(dá)的缺失率不同,MLH1蛋白表達(dá)缺失率為24%~28%,MLH2為7%~8%,MLH6為6%~21%,PMS2為28%~40%[16-17]。本研究結(jié)果顯示,82例子宮內(nèi)膜癌組織中,PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表達(dá)缺失率分別為9.8%、8.5%、7.3%、15.9%,總蛋白表達(dá)缺失率為35.4%,與上述研究結(jié)果較為一致。

影響MMR蛋白表達(dá)缺失的因素十分復(fù)雜,有研究報(bào)道,相較于年齡低于50歲的子宮內(nèi)膜癌患者,年齡超過(guò)50歲的子宮內(nèi)膜癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失率更高。本研究結(jié)果顯示,年齡>50歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率分別明顯高于年齡≤50歲、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。晉薇等[18]研究顯示,高FIGO分期、深肌層浸潤(rùn)以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失率較高。本研究結(jié)果顯示,MMR蛋白表達(dá)缺失均發(fā)生在子宮內(nèi)膜腺癌患者中,不同F(xiàn)IGO分期、浸潤(rùn)深度子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與上述研究結(jié)果不同,可能與人種和地域因素有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

MSI是由于機(jī)體MMR系統(tǒng)喪失導(dǎo)致復(fù)制錯(cuò)誤的結(jié)果,常見(jiàn)于遺傳性腫瘤,在散發(fā)性腫瘤中也存在一定比例的MSI陽(yáng)性率。有研究報(bào)道,MSI與患者性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤浸潤(rùn)深度均無(wú)相關(guān)性。彭俊玲等[19]研究發(fā)現(xiàn),MSI與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的年齡有關(guān);而趙巖等[20]研究顯示,子宮內(nèi)膜癌組織中MSI與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān),但MSI更傾向發(fā)生于分化程度高及子宮內(nèi)膜腺癌組織中。本研究結(jié)果顯示,年齡>50歲子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽(yáng)性率高于年齡≤50歲的患者,子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽(yáng)性率高于非子宮內(nèi)膜腺癌患者,低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽(yáng)性率低于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同F(xiàn)IGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽(yáng)性率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

研究認(rèn)為,MMR蛋白表達(dá)缺失的患者往往預(yù)后較好,其可能的機(jī)制為MMR蛋白表達(dá)缺失的組織中,微衛(wèi)星序列突變率上升,進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生新的肽段,而其中一些肽段作為新抗原可被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并處理,從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致免疫細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增多[21]。已有研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌以及非小細(xì)胞肺癌中,具有MMR蛋白表達(dá)缺失的患者淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)有所增加[9],而MSI與MMR蛋白表達(dá)缺失密切相關(guān)[19-20]。張學(xué)華等[22]研究發(fā)現(xiàn),MMR蛋白表達(dá)缺失子宮內(nèi)膜癌患者中CD4+的水平顯著高于MMR蛋白表達(dá)未缺失的患者。本研究結(jié)果顯示,MMR蛋白表達(dá)缺失患者的CD4+、CD8+水平均明顯高于MMR蛋白表達(dá)未缺失的患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MSI陽(yáng)性患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率為88.24%,明顯高于MSI陰性患者的21.54%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明MMR蛋白表達(dá)缺失的子宮內(nèi)膜癌組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn),患者的免疫功能有所提高,而MMR蛋白表達(dá)缺失可能參與MSI的發(fā)生,提示其可作為評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的指標(biāo)。然而,本研究具有一定的局限性,樣本量較小,且未對(duì)不同缺失蛋白的病例進(jìn)行分層分析。因此,仍需加大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述,MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,年齡>50歲、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率較高。MMR蛋白表達(dá)缺失的組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn),患者的免疫功能有所提高。

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