劉鑫，李民，高興春#

1西安醫(yī)學院，西安 710000

2陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，西安 710068

膠質(zhì)母細胞瘤是神經(jīng)外科最常見原發(fā)性顱腦腫瘤，好發(fā)于幕上大腦半球各處，呈浸潤性生長，在所有膠質(zhì)瘤中惡性程度最高，?？赏瑫r侵犯多個腦葉及深部結(jié)構(gòu)，臨床療效較差，預(yù)后不良，70%～80%患者的病程僅3～6個月，病程超過1年的患者不超過10%[1-2]。目前，僅發(fā)現(xiàn)遺傳因素、環(huán)境因素及腦部炎癥等因素可促進膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展，且這些因素對幫助臨床診療意義不大，而基于分子水平的相關(guān)研究較少[3]。數(shù)據(jù)顯示，近年來，膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病率明顯升高，探討其發(fā)病機制，提高其早期診斷率及治療有效率尤為重要[4]。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物5（immunoglobulin-like transcript 5，ILT5）基因是ILT家族的重要成員之一，主要表達于單核細胞、淋巴細胞及樹突狀細胞等免疫細胞表面，與機體免疫密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ILT4在非小細胞肺癌和卵巢癌中均呈低表達，通過與其配體結(jié)合介導細胞內(nèi)免疫絡(luò)氨酸抑制基序的負性調(diào)節(jié)，從而抑制機體淋巴細胞增殖與活化[6-7]。目前，關(guān)于ILT5與膠質(zhì)母細胞瘤的研究較少，具有一定研究價值。本研究探討ILT5在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達情況，分析其與患者臨床特征的關(guān)系及對預(yù)后評估的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2015年11月在陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的膠質(zhì)母細胞瘤患者。納入標準：①臨床癥狀、實驗室檢測、影像學檢查及術(shù)后病理診斷結(jié)果確診為膠質(zhì)母細胞瘤；②術(shù)前未接受任何其他治療，生存期＞3個月；③卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分≥50分；④臨床資料及隨訪資料均完整。排除標準：①繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤；②膠質(zhì)母細胞瘤復發(fā)；③合并其他惡性腫瘤；④失訪或因其他原因死亡。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入92例膠質(zhì)母細胞瘤患者，其中男50例，女42例；年齡：＞40歲60例，≤40歲32例；KPS評分為（72.47±4.35）分。同期選取行正常腦組織切除減壓術(shù)的患者，排除合并腦部及其他部位良惡性腫瘤的患者，本研究共納入40例行正常腦組織切除減壓術(shù)的患者，其中男24例，女16例；年齡：＞40歲26例，≤40歲14例；KPS評分為（73.39±4.86）分。兩組患者性別、年齡及KPS評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本制備 取膠質(zhì)母細胞瘤患者的膠質(zhì)瘤組織和行正常腦組織切除減壓術(shù)的患者的正常腦組織，生理鹽水洗凈血跡及脂肪組織等，分為兩部分：一部分保存于RNA保存液中，-80℃冰箱保存；另一部分用石蠟包埋，室溫常規(guī)保存待檢。

1.2.2 實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測ILT5mRNA 的相對表達量將組織從-80℃冰箱取出解凍后棄保存液，緩沖液洗凈：研磨組織3 min，按比例加入Trizol液，充分均漿，離心棄沉淀，加氯仿震蕩混勻，室溫靜置10 min，離心留上清，按比例加異戊醇，離心留上清，再加入75%乙醇，真空干燥8 min，提取總RNA。依據(jù)試劑盒說明書制備cDNA，反應(yīng)體系：4 μl緩沖液、4 μl混合酶、2 μl引物、4 μl總RNA液和6 μl DEPC水；反應(yīng)條件：30 ℃ 8 min，42 ℃ 30 min，72 ℃ 10 min；cDNA制備完成，于-20℃冰箱保存。實時熒光PCR擴增，反應(yīng)液20 μl，包括1 μl上下游引物、1 μl cDNA、0.5 μl Taq DNA 聚合酶、0.5 μl dNTP、5 μl PCR混合液和7.5 μl DEPC水；擴增條件：95℃先2 min后15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct計算ILT5mRNA的相對表達量，其中△Ct=CtILT5-CtGAPDH。ILT5上游引物為5'-GGCTGAGTCTGGGCCCCAGGACCCGCAT-3'，下游引物為5'-ATGCTAGGTAACGTAGCTTACGGTTACC-3'；GAPDH上游引物為5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'，下游引物為5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'。

1.2.3 免疫組化法檢測ILT5蛋白的相對表達量石蠟標本切片，0.5 mm左右，60℃烤片待檢。二甲苯聯(lián)合不同濃度乙醇進行脫蠟，微波爐高溫修復，將組織置于3%的H2O2中3 min，緩沖液清洗3遍，從而阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。加入一抗（稀釋濃度為1∶300），4℃冰箱過夜，緩沖液清洗3遍；加入二抗（基本沒過組織即可），室溫避光孵育30 min，緩沖液清洗3遍。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色10 s左右（具體根據(jù)實驗期情況而定）、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、透明、封片。選擇視野清晰，染色良好的5個視野進行計數(shù)，每個視野分別計數(shù)1000個。

結(jié)果判定[8]：ILT5蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，本研究用染色指數(shù)法進行判定，陽性細胞所占比例評分：未見計0分，陽性細胞所占比例＜10%計1分，陽性細胞所占比例為10%～49%計2分，陽性細胞所占比例為50%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分；染色強度評分：無顯色計0分，淡黃色染色計1分，黃色染色計2分，棕黃色染色3分；將陽性細胞所占比例評分與染色強度評分相乘：＞4分為高表達，≤4分為低表達。

1.3 隨訪方法

所有膠質(zhì)瘤組患者均須隨訪，隨訪方式主要包括門診復診、電話及微信平臺等，隨訪截止2018年11月，共3年，中位隨訪時間為26個月。詳細記錄患者復發(fā)及生存狀況，計算總生存期（overall survival，OS）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Logrank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ILT5mRNA相對表達量和ILT5蛋白表達情況的比較

膠質(zhì)瘤組織中ILT5mRNA的相對表達量明顯低于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。膠質(zhì)瘤組織ILT5蛋白表達率低于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中ILT5 mRNA相對表達量和ILT5蛋白表達情況的比較

2.2 不同臨床特征膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5mRNA相對表達量的比較

不同性別膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5mRNA相對表達量的比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學分級、腫瘤直徑和腫瘤部位膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5mRNA相對表達量的比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5 mRNA相對表達量的比較（n=92）

2.3 不同臨床特征膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況的比較

不同性別、腫瘤部位膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學分級及腫瘤直徑膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況的比較（n=92）

2.4 ILT5蛋白與膠質(zhì)母細胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系

ILT5蛋白低表達患者中位生存時間為20.1個月（95%CI：17.4～22.8個月），短于ILT5蛋白高表達患者的28.1個月（95%CI：25.3～31.0個月），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ILT5蛋白高表達患者3年生存率44.1%（15/34），高于ILT5蛋白低表達患者的22.4%（13/58），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.767，P=0.003）。（圖 1）

圖1 ILT5蛋白高表達（n=34）與ILT5蛋白低表達（n=58）膠質(zhì)母細胞瘤患者的生存曲線

3 討論

ILT是近年發(fā)現(xiàn)的HLA-1受體家族，通過與相關(guān)配體結(jié)合可抑制細胞免疫反應(yīng)[9-10]。目前，研究較多的抑制性ILT主要包括ILT2、ILT3和ILT4，均含有免疫絡(luò)氨酸抑制基序和IgSF區(qū)，與免疫相關(guān)性疾病密切相關(guān)；近年發(fā)現(xiàn)其還可在腫瘤細胞中表達，但具體作用機制尚不清楚[11-13]。ILT3和ILT4均在肺癌中異常表達，高愛琴[14]通過對57例非小細胞肺癌患者和A549/H1975/H460/A427四類非小細胞肺癌細胞株研究發(fā)現(xiàn)，ILT3在非小細胞肺癌組織及細胞中均呈陽性表達，可明顯降低TIL數(shù)量，但與患者性別、年齡、腫瘤類型、分化程度及臨床分期等臨床特征無關(guān)。張義[15]則通過50例胃癌組織、癌旁正常組織和6株胃癌細胞株中ILT2、ILT3及ILT4表達水平進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ILT2與胃癌相關(guān)性最強，有望成為胃癌診療的有效指標，與淋巴細胞HLA-G分子陽性表達密切相關(guān)，上述研究提示，ILT在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，但近年缺少ILT與腫瘤相關(guān)的研究報道。

本研究通過實時熒光PCR和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中ILT5mRNA的相對表達量和ILT5蛋白的表達率均低于正常腦組織，表明ILT5在膠質(zhì)母細胞瘤中低表達，可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。隨后，本研究分析ILT5與膠質(zhì)母細胞瘤臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同年齡、WHO分級及腫瘤直徑膠質(zhì)母細胞瘤患者ILT5mRNA的相對表達量和ILT5蛋白表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示年齡越小、組織學分級高（Ⅲ～Ⅳ級）、腫瘤直徑越大的膠質(zhì)母細胞瘤患者，ILT5mRNA的相對表達量越低。隨訪及Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖發(fā)現(xiàn)，ILT5蛋白低表達患者中位生存期較短，3年總生存率較低，可認為年齡越小、組織學分級越高、腫瘤直徑越大的膠質(zhì)母細胞瘤患者預(yù)后越差。本研究分析了ILT5在膠質(zhì)母細胞瘤中的應(yīng)用價值，但具體作用機制及診療價值尚不清楚，有待后續(xù)探討。

綜上所述，ILT5在膠質(zhì)母細胞瘤中低表達，可能與年齡、WHO分級、腫瘤直徑及預(yù)后等密切相關(guān)，有望成為膠質(zhì)母細胞瘤診療的新靶點。