張馳，石嵐，王培培，李月香，張詩卉

北京新里程腫瘤醫(yī)院檢驗科，北京100161

甲狀腺癌是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，近年來，中國部分地區(qū)甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增高。侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致甲狀腺癌患者死亡的重要原因。腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤是復(fù)雜的動態(tài)過程，與腫瘤基因失控以及細胞因子和其受體的相互作用關(guān)系密切[1]。中期生長因子屬于肝素結(jié)合生長因子，研究顯示，其在正常人體血清和組織中含量極少，但是在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，對于胚胎發(fā)育期細胞的生長和分化具有重要影響，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。人類白細胞抗原G屬于非經(jīng)典的組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原，其異常表達會導(dǎo)致腫瘤細胞逃避腫瘤的免疫監(jiān)視系統(tǒng)，在多種惡性腫瘤中的表達異常升高[2]。目前，臨床關(guān)于聯(lián)合分析中期生長因子和人類白細胞抗原G在甲狀腺癌中的表達情況及其與患者預(yù)后關(guān)系的報道較少見。因此，本研究探討中期因子（midkine，MK）、可溶性人類白細胞抗原-G（soluble human leukocyte antigen-G，sHLA-G）在甲狀腺癌中的表達水平及對其甲狀腺癌的診斷價值，以期為臨床提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2019年12月于北京新里程腫瘤醫(yī)院接受治療的89例甲狀腺癌患者和70例甲狀腺良性病變（甲狀腺腺瘤）患者，分別作為甲狀腺癌組和甲狀腺良性病變組。納入標(biāo)準：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為甲狀腺癌或甲狀腺腺瘤；②無內(nèi)分泌治療史；③年齡≥18歲；④依從性好。排除標(biāo)準：①合并急慢性感染；②合并肝、腎功能不全；③合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病及其他嚴重疾??；④入組前接受過免疫調(diào)節(jié)劑、激素類藥物等的治療。89例甲狀腺癌患者中，女74例，男15例；平均年齡為（46.67±9.87）歲；平均體重指數(shù)為（22.45±2.10）kg/m2。70例甲狀腺良性病變（甲狀腺腺瘤）患者中，女60例，男10例；平均年齡為（47.10±10.02）歲；平均體重指數(shù)為（22.23±2.06）kg/m2。另選取50例同期健康體檢者作為健康對照組，其中，女41例，男9例；平均年齡為（46.84±8.88）歲；平均體重指數(shù)為（22.50±2.19）kg/m2。3組研究對象的性別、年齡、體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

抽取3組研究對象的空腹靜脈血5 ml，以3000 r/min的離心速度離心10 min，分離血清，設(shè)置標(biāo)準品孔、樣本孔和空白孔，將50 μl不同濃度的標(biāo)準品和樣本加入孔中，加入100 μl由辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，空白孔既不加標(biāo)準品、待測樣品，也不加檢測抗體。封住反應(yīng)孔，在37℃恒溫箱內(nèi)放置60 min。倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，將350 μl洗滌液加滿孔內(nèi)，靜置1 min后倒掉，拍干，重復(fù)4～5次。加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。將50 μl終止液分別加入每孔，在450 nm波長下測定各孔的光密度值（optical density，OD）值，以標(biāo)準品濃度作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。所用試劑均由上海江萊生物科技有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積分析MK、sHLA-G對甲狀腺癌的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對象血清MK、sHLA-G水平的比較

甲狀腺癌組、甲狀腺良性病變組、健康對照組患者的血清MK、sHLA-G水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。甲狀腺癌組患者的血清MK、sHLA-G水平均高于甲狀腺良性病變組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；甲狀腺良性病變組患者的血清MK、sHLA-G水平均高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 3組研究對象血清MK、sHLA-G水平的比較（±s）

表1 3組研究對象血清MK、sHLA-G水平的比較（±s）

注：a與健康對照組比較，P＜0.05；b與甲狀腺良性病變組比較，P＜0.05

組別甲狀腺癌組（n=89）甲狀腺良性病變組（n=70）健康對照組（n=50）F值P值MK（pg/ml）372.26±101.14a b 288.87±100.54a 210.01±76.64 89.944 0.000 sHLA-G（ng/ml）42.26±11.15a b 31.54±9.88a 6.87±1.22 21.064 0.000

2.2 甲狀腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平與臨床特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的血清MK水平均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.857、2.093，P＜0.05）；腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的血清sHLA-G水平均明顯高于腫瘤直徑＜2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.977、-9.895、4.217，P＜0.01）。（表2）

2.3 血清MK、sHLA-G水平對甲狀腺癌的診斷價值

血清MK、sHLA-G水平診斷甲狀腺癌的曲線下面積分別為 0.701（95%CI：0.596～0.806）和 0.804（95%CI：0.720～0.889），P＜0.05，截斷值分別為301.24 pg/ml和39.79 ng/ml，靈敏度分別為62.0%和56.0%，特異度分別為76.0%和99.4%。（圖1）

3 討論

甲狀腺癌可發(fā)生于各個年齡段，一般女性的發(fā)病率高于男性，患者早期出現(xiàn)頸部緩慢增長的腫物，臨床體征不明顯，發(fā)展至晚期，腫物會對人體組織造成壓迫與侵犯，導(dǎo)致患者出現(xiàn)吞咽、呼吸和發(fā)音功能的異常，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和生命安全[3-4]。甲狀腺腫瘤的發(fā)病因素較多，包括電離輻射、碘攝入異常以及遺傳等，因此，早發(fā)現(xiàn)、早鑒別對甲狀腺腫瘤的后期診治和預(yù)后評估具有重要意義[5]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤具有自主性生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、逃避人體免疫系統(tǒng)的攻擊等特性，保持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)可以抑制腫瘤的發(fā)生，而組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡就會促進惡性腫瘤表型的出現(xiàn)[6]。近年來，隨著臨床診療水平的提升，越來越多的甲狀腺疾病早期即可被診斷，但是，對甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷存在較高的誤診率和漏診率，甲狀腺結(jié)節(jié)與其他甲狀腺疾病可能存在部分重疊性的影像學(xué)特征，如超聲雖然對于囊性病變的診斷準確度較高，在判斷結(jié)節(jié)的大小、部位以及引導(dǎo)穿刺方面具有明顯優(yōu)勢，但對結(jié)節(jié)良惡性質(zhì)的鑒別診斷價值一般[7-8]。分子生物學(xué)已經(jīng)證實各種致瘤因素均會造成局部組織細胞基因無法調(diào)控細胞正常的生長、凋亡過程，從而出現(xiàn)異常增生，影響腫瘤患者的療效和預(yù)后。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多步驟的連續(xù)過程，期間會受到多種相關(guān)基因的調(diào)控，包括腫瘤轉(zhuǎn)移基因的激活、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的失活和多種基因之間的相互作用[9]。

圖1 血清MK、sHLA-G 水平診斷甲狀腺癌的ROC曲線

本研究分析了MK、sHLA-G在甲狀腺癌中的表達情況，sHLA-G屬于非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體，可通過多種機制參與母胎免疫耐受的誘導(dǎo)與維持。有研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，僅sHLA-G在腫瘤組織中表達，其余亞型則均未檢測到，正常人體sHLA-G主要由樹突狀細胞、單核細胞等產(chǎn)生，通過體液循環(huán)可以存在于全身的組織器官中，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)，保護腫瘤細胞逃逸宿主免疫監(jiān)視[10]。研究發(fā)現(xiàn)，sHLA-G一方面可以直接抑制細胞的免疫功能，阻斷效應(yīng)細胞作用的發(fā)揮；另一方面還可以通過誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)細胞調(diào)節(jié)人體免疫功能[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者腹腔積液中的sHLA-G濃度高于良性腫瘤患者腹腔積液中的sHLA-G濃度，提示sHLA-G對腫瘤的良惡性質(zhì)具有鑒別診斷意義[12]。MK是肝素結(jié)合生長因子，與器官形成關(guān)系密切，在成年組織中很少表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[13]。在細胞的表面存在對葡氨聚糖肝素和硫酸肝素具有高度親和力的多肽，MK表達異常會導(dǎo)致同細胞表面上述多肽的結(jié)合異常，導(dǎo)致惡性腫瘤生長、血管生成，同時還可以促進嗜中性粒細胞與巨噬細胞等多種細胞的移動，有助于腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。另外，MK的寡核苷酸反義鏈可以抑制腫瘤細胞的生長和腫瘤血管的形成，小鼠直腸腫瘤與神經(jīng)母細胞瘤中均存在MK缺失，提示利用MK基因產(chǎn)物缺失并阻斷細胞信號傳導(dǎo)可能能夠為甲狀腺惡性腫瘤提供了新的治療途徑，為臨床拓展新的思路與方法[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者的血清MK和sHLA-G水平高于甲狀腺良性病變和健康受試者，提示MK和sHLA-G在甲狀腺癌中高表達。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者（P＜0.05），腫瘤直徑≥2 cm的甲狀腺癌患者的血清sHLA-G水平明顯高于腫瘤直徑＜2 cm的甲狀腺癌患者（P＜0.01），提示MK、sHLA-G水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，sHLA-G水平還與腫瘤直徑有關(guān)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清MK、sHLA-G水平診斷甲狀腺癌的ROC曲線下面積分別為0.701和0.804，靈敏度分別為62.0%和56.0%，特異度分別為76.0%和99.4%，提示血清MK、sHLA-G水平對甲狀腺癌的診斷具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)了MK、sHLA-G的過表達與甲狀腺癌患者腫瘤直徑、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，與以往研究相似，同時通過繪制ROC曲線進一步證實了其在甲狀腺癌診斷中的靈敏度和特異度，為臨床合理尋找診斷甲狀腺癌標(biāo)志物物提供了依據(jù)。

綜上述所，甲狀腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平較高，與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑有一定關(guān)系；血清MK、sHLA-G水平在甲狀腺良惡性病變的鑒別診斷中有一定的應(yīng)用價值。但是，本研究納入的病例數(shù)量較少，隨訪時間短，而且對MK、sHLA-G水平與患者預(yù)后的關(guān)系未進行分析，對具體機制和相關(guān)信號通路未進一步闡述，故在今后的研究中，仍需要通過建立動物模型以及開展細胞學(xué)研究深入論證。