趙星月，李倩，劉文靜，關(guān)海晴，李成，王際輝,3，王亮

·綜 述·

蛹蟲草菌生物合成蟲草素的研究進展

趙星月1，李倩2，劉文靜1，關(guān)海晴1，李成1，王際輝1,3，王亮1

1 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034 2 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622 3 東莞理工學(xué)院 化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞 523808

蛹蟲草是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，蟲草素是蛹蟲草的主要活性成分，具有抗癌、抗腫瘤、抗病毒等多種生理功能。蛹蟲草菌液體發(fā)酵是最有希望實現(xiàn)高效生產(chǎn)蟲草素的途徑，但現(xiàn)階段生產(chǎn)強度低，亟需應(yīng)用發(fā)酵工程及代謝工程手段提高蟲草素產(chǎn)量。文中對液體發(fā)酵體系中培養(yǎng)基組分 (碳/氮源、前體物質(zhì)、金屬離子等) 和培養(yǎng)條件 (pH、溶氧量、光照等) 對蟲草素產(chǎn)量的影響進行了總結(jié)，并對蟲草素的分離純化、生物合成基因簇及合成代謝途徑進行了闡述，最后探討了實現(xiàn)蟲草素高效生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

蟲草素，蛹蟲草菌，液體發(fā)酵，生物合成途徑，高效生產(chǎn)

1950年Cunningham等首次從藥用蕈菌蛹蟲草菌的發(fā)酵液中分離得到蟲草素[1]。是一種昆蟲病原真菌，寄生于鱗翅昆蟲的幼蟲和蛹中。蟲草素，即3′-脫氧腺苷，分子式為C10H13N5O3，是一種核苷類似物，由一個嘌呤分子 (腺嘌呤)和一個核糖分子 (呋喃核糖) 組成，且兩者通過β-N9-糖苷鍵連接。蟲草素結(jié)構(gòu)類似腺苷 (圖1)，但缺乏3′-OH，正是由于這點不同，才賦予蟲草素多種生理功能。

蟲草素作為蛹蟲草的主要活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、提高機體綜合抗病能力、抗菌消炎等功效[2]，自發(fā)現(xiàn)之后備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。蟲草素分子存在一個游離的-OH，作為核苷類似物嵌入到腫瘤細(xì)胞的DNA和RNA中可以阻止其合成、影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等，從而抑制腫瘤細(xì)胞核酸的合成[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素能夠有效抑制白血病[6]、結(jié)腸癌、肝癌[2]、腎癌、肺癌[7]、胃癌[7]、乳腺癌[8]、宮頸癌[9]、膀胱癌、前列腺癌等癌細(xì)胞的增殖[10]，此外，蟲草素還對大腸桿菌、鏈球菌、類腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等病原菌[11-13]以及白色念珠菌、克魯氏假絲酵母等致病性真菌有明顯的抑制作用[14]。下面就蟲草素來源、發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化及生物合成途徑相關(guān)研究進行綜述。

圖1 蛹蟲草子實體 (A)、腺苷 (B) 和蟲草素 (C) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 微生物發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素

蟲草素可以通過化學(xué)合成法和生物法獲得。化學(xué)合成法原料成本高、合成工藝繁瑣、產(chǎn)物收率低且副產(chǎn)物多，限制了其工業(yè)應(yīng)用[15]。生物法生產(chǎn)蟲草素主要有兩種途徑：一是直接從天然或人工培育的蛹蟲草子實體中提取，二是經(jīng)過液體發(fā)酵，從蛹蟲草菌絲體和發(fā)酵液中提取。第一種途徑主要問題是蛹蟲草子實體的培養(yǎng)周期長 (約60 d)、培養(yǎng)條件復(fù)雜、不易控制，且蟲草素產(chǎn)量較低，不能滿足工業(yè)原料需求。第2種途徑液體發(fā)酵生產(chǎn)周期短 (約15 d)，發(fā)酵過程易于控制，產(chǎn)物生成目的性強。液體發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于蟲草素生產(chǎn)，且逐漸發(fā)展為主要生產(chǎn)手段，并且在菌種改良、過程工程優(yōu)化等方面也積累了大量工作。

1.1 蟲草素生產(chǎn)菌

能夠合成蟲草素的微生物包括蛹蟲草菌[1,16]、構(gòu)巢曲霉[17]、九州蟲草菌[18]等絲狀真菌。其中，自然條件下蛹蟲草菌的蟲草素含量較高，常用于發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的研究。國內(nèi)外開展了大量誘變育種工作以獲得高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草菌株：Das等利用高能質(zhì)子束誘變技術(shù)篩選獲得 8-氮鳥嘌呤抗性突變株，弱化了蟲草素積累產(chǎn)生的反饋抑制，液體淺層培養(yǎng)21 d蟲草素產(chǎn)量達(dá)到3.1 g/L，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高約72%[19]；Kang等通過孢子雜交手段獲得高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草菌KSP8，蟲草素含量提高約116.67%，達(dá)到6.63 mg/g[20]；王亮等通過超聲波和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理獲得黃嘌呤鳥嘌呤雙重營養(yǎng)缺陷型突變體，通過阻斷黃嘌呤和鳥嘌呤的合成代謝，使代謝通量更多地流向前體物質(zhì)腺嘌呤或腺苷，蟲草素產(chǎn)量提高40%，蟲草素產(chǎn)量達(dá)到1.76 g/L[21]。

1.2 優(yōu)化培養(yǎng)基成分提高蟲草素發(fā)酵產(chǎn)量

微生物培養(yǎng)過程中，碳源、氮源、前體物質(zhì)、金屬離子等培養(yǎng)基組分的種類及含量變化對菌體生長和產(chǎn)物合成會產(chǎn)生不同程度的影響 (表1)。

1.2.1 碳、氮源

碳、氮是細(xì)胞的基本組成元素，碳源、氮源以及C/N比的選擇都會對細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)生較大影響。大量碳源優(yōu)化實驗表明，葡萄糖是蛹蟲草菌發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的最優(yōu)碳源[22]：Mao等考察了乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和木糖等多種碳源對蛹蟲草菌液體發(fā)酵體系蟲草素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄糖為最適碳源，當(dāng)以42.0 g/L葡萄糖進行液體發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量最高，第18天達(dá)到 (345.4±8.5) mg/L[24]；Wongsa等比較了葡萄糖、蔗糖和木糖3種碳源，也發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源時蟲草素產(chǎn)量最高，達(dá)到 (249.74±12.71) mg/L，較木糖和蔗糖組分別提高6.09%和17.41%，但單位細(xì)胞的蟲草素得率YP/X卻是木糖組最高 (0.094 g/g DCW)，為葡萄糖和蔗糖組的1.92倍和2.41倍[40]，這可能是由于菌體生長差異導(dǎo)致的 (生物量：葡萄糖≈蔗糖>木糖)。

葡萄糖是許多微生物生長的常見碳源和能源，多數(shù)研究都集中在將葡萄糖轉(zhuǎn)化為蟲草素，但葡萄糖的快速代謝會導(dǎo)致多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成速率降低，并抑制其他碳源的利用。Tang等以葡萄糖為基礎(chǔ)碳源同時補加棉籽油、花生油等植物油作為第二碳源，由于培養(yǎng)基中植物油的溶解度低，可避免碳分解代謝物的阻遏作用，同時改變呼吸熵，強化了碳通量流向蟲草素的生物合成，在40 g/L葡萄糖基礎(chǔ)上添加20 g/L花生油作為初始碳源，液體發(fā)酵20 d蟲草素產(chǎn)量可提高約217%，達(dá)到5.29 g/L[23]。

在氮源方面，銨鹽能夠顯著提高蟲草素產(chǎn)量，Mao等在蛹蟲草菌液體深層培養(yǎng)過程進行銨鹽流加補料，蟲草素產(chǎn)量達(dá) (420.5±15.1) mg/L，較分批培養(yǎng)提高70%[41]。Leung等報道在培養(yǎng)第3天流加補料10 mmol/L NH4Cl，顯著刺激了蟲草素的生物合成，菌絲體蟲草素產(chǎn)量增加312.3% (由28.5 μg/g增加到117.5 μg/g)[28]。Shih等發(fā)現(xiàn)C/N比為1︰1.5時有利于腺苷和蟲草素的積累，但C/N比過低 (1︰3) 會導(dǎo)致其產(chǎn)量減少[27]。有機氮源對蛹蟲草菌代謝的貢獻(xiàn)則主要是促進細(xì)胞生長[30-31]，陳磊等發(fā)現(xiàn)使用牛肉膏、蛋白胨等有機氮源時，菌絲濃密，而使用無機氮源(NH4)2SO4和NH4Cl時，菌絲稀疏[31]。Raethong等構(gòu)建了蛹蟲草菌的基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，基于此設(shè)計合成培養(yǎng)基組分以實現(xiàn)菌體快速生長和蟲草素的大量積累，當(dāng)C/N比控制為8︰1時，培養(yǎng)液中蟲草素產(chǎn)量達(dá)到 (377.6±5.5) mg/L，較未優(yōu)化培養(yǎng)基提高246.42%[32]。

1.2.2 前體物質(zhì)

前體物質(zhì)能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中，添加合適的前體物質(zhì)一般可以顯著提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。腺苷和腺嘌呤等嘌呤代謝的中間代謝物與蟲草素結(jié)構(gòu)類似，被認(rèn)為可能是參與蟲草素生物合成的前體物質(zhì)。Das等添加6 g/L腺苷作為前體物質(zhì)進行高產(chǎn)突變株液體發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量高達(dá)8.57 g/L，較對照組提高28.10%[19,29]。Sari等向培養(yǎng)基中添加6.75 g/L腺嘌呤，蟲草素產(chǎn)量提高了360%，達(dá)到6.24 g/L[34]。組合添加腺嘌呤和甘氨酸也能顯著提高蟲草素產(chǎn)量：Masuda等實驗發(fā)現(xiàn)1 g/L腺嘌呤和16 g/L甘氨酸為最優(yōu)前體添加組合，蟲草素產(chǎn)量提高310%，達(dá)2.5 g/L[33]；康超等提出黑暗振蕩條件下 (光照影響見下文) 添加前體物質(zhì) (1 g/L腺嘌呤和16 g/L甘氨酸) 是提高蟲草素產(chǎn)量的最優(yōu)方案，其蟲草素發(fā)酵產(chǎn)量可提高39%，達(dá)到1.02 g/L[35]。

表1 培養(yǎng)基成分對蟲草素產(chǎn)量的影響

1.2.3 金屬離子

金屬離子與細(xì)胞的生長和代謝有著密切的關(guān)系，過量或缺乏都會對細(xì)胞功能造成影響。Hung等利用海水開展蛹蟲草菌發(fā)酵實驗，發(fā)現(xiàn)一定濃度下Mg2+、Na+、Ca2+和Fe2+有利于蟲草素積累[38]。Fan等發(fā)現(xiàn)液體發(fā)酵體系Fe2+促進蟲草素的積累，初始添加1 g/L FeSO4·7H2O，蟲草素產(chǎn)量達(dá) 596.59 mg/L，較未添加組提高約70%[37]。

左言美等發(fā)現(xiàn)外源添加高濃度Zn2+引起細(xì)胞內(nèi)鋅積累，引發(fā)的氧化脅迫抑制菌體生長，35 g/L鋅質(zhì)量濃度為蛹蟲草菌菌體生長極限濃度，蟲草素的含量也隨鋅質(zhì)量濃度的增加而顯著降低[39]。然而，筆者所在研究組發(fā)現(xiàn)，在蛹蟲草菌液體深層培養(yǎng)體系 (合成培養(yǎng)基) 中添加10 mmol/L Zn2+，25 ℃培養(yǎng)15 d后培養(yǎng)液中蟲草素濃度達(dá)到(1 553.21±105.77) mg/L，是無鋅對照體系 ((225.66±20.53) mg/L) 的6.88倍 (數(shù)據(jù)待發(fā)表)，初步推測鋅離子參與全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響蟲草素生物合成。

1.2.4 其他因素

維生素與氨基酸等也證明與蟲草素積累相關(guān)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充10 mg/L生長因子 (VB1、VB6、VB7、VB11、α-萘乙酸 (NAA)、3-吲哚乙酸或2,4-二氯苯氧乙酸)，發(fā)現(xiàn)添加VB1、VB11和NAA有利于蟲草素積累，添加10 mg/L VB1蟲草素產(chǎn)量最高，液體培養(yǎng)35 d可達(dá)(1 159.34±109.01) mg/L，較對照組提高約95.8%[25]。Raethong等通過代謝組學(xué)分析比較了不同碳源條件下蛹蟲草菌的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸代謝與蟲草素合成存在關(guān)聯(lián)[42]。Oh等利用GC-MS分析蛹蟲草子實體中的代謝物，認(rèn)為蟲草素生物合成與谷氨酰胺及谷氨酸代謝相關(guān)[43]。

綜上所述，培養(yǎng)基成分對于任何發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量都非常重要，特別是碳、氮源，這些組分與細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物的生物合成直接相關(guān)。蟲草素作為次級代謝產(chǎn)物，其生物合成主要由嘌呤代謝中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化形成，表明蟲草素合成代謝與細(xì)胞生長 (初級代謝) 存在一定關(guān)聯(lián)，因此，在選擇碳、氮源時需要同時考慮產(chǎn)物合成和細(xì)胞生長。多數(shù)研究表明，當(dāng)使用單一碳源進行蟲草素發(fā)酵時，葡萄糖為蟲草素發(fā)酵的最佳碳源[22]。雖然在以木糖為碳源時，單位細(xì)胞的蟲草素得率YP/X高于葡萄糖，但葡萄糖較木糖更有利于蛹蟲草菌的生長[40]。在氮源選擇方面，有機氮源含多種氨基酸及生長因子，能夠顯著促進菌體生長，但不利于蟲草素合成；而無機氮源銨鹽雖不利于菌體生長，但能促進蟲草素大量積累[28,41]。由此可見，蛹蟲草菌在菌體生長和產(chǎn)物合成階段對碳、氮源的偏好不同，因此可應(yīng)用兩步法發(fā)酵或混合碳源發(fā)酵策略提高蟲草素產(chǎn)量，即先利用葡萄糖、蛋白胨 (或酵母浸粉等) 作為碳、氮源，提供菌體生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，后期切換為木糖 (或植物油等)、銨鹽作為碳、氮源，促進蟲草素合成；或利用葡萄糖作為基礎(chǔ)碳源，同時補木糖、植物油等其他碳源進行混合碳源發(fā)酵。除碳、氮源外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量前體物質(zhì) (如1 g/L腺嘌呤和16 g/L甘氨酸)、補充適量金屬元素 (如3.6 mmol/L Fe2+、10 mmol/L Zn2+) 和維生素 (如 10 mg/L VB1) 可進一步提高蟲草素產(chǎn)量。

1.3 優(yōu)化培養(yǎng)條件提高蟲草素發(fā)酵產(chǎn)量

除了培養(yǎng)基成分優(yōu)化外，培養(yǎng)條件優(yōu)化也是一種常用的提高蟲草素產(chǎn)量的過程工程策略，如pH、溶氧量以及光照條件等 (表2)。

表2 培養(yǎng)條件對蟲草素產(chǎn)量影響

1.3.1 溶氧量

溶氧量 (DO) 作為發(fā)酵的重要指標(biāo)，對蟲草素的產(chǎn)量存在顯著影響。Mao等在蛹蟲草菌液體培養(yǎng)體系提出了兩階段溶氧控制策略：前4天DO控制在50%–60%，之后DO控制在30%左右，第13天蟲草素產(chǎn)量最高達(dá)到194.5 mg/L，較無DO控制體系提高10%；進一步在5-L渦輪攪拌生物反應(yīng)器中應(yīng)用該策略，蟲草素產(chǎn)量提高了約15%[44]。

Shih等考察搖瓶培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)和振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)3種不同溶氧條件的培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)兩階段發(fā)酵體系蟲草素產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別為 1 103.0 mg/L和34.4 mg/(L·d)，較靜置 (220.3 mg/L，9.2 mg/(L·d)) 和搖瓶培養(yǎng)體系 (135.0 mg/L，11.2 mg/(L·d)) 蟲草素產(chǎn)量和生產(chǎn)強度顯著提 高[27]。此外，Suparmin等通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析深層液體發(fā)酵和淺層液體發(fā)酵體系的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)淺層液體發(fā)酵體系的氧缺乏有利于蟲草素積累[51]。

1.3.2 pH

培養(yǎng)體系pH變化是細(xì)胞酸性及堿性物質(zhì)代謝的綜合體現(xiàn)。在蛹蟲草菌液體發(fā)酵體系，pH隨著發(fā)酵的進行逐漸下降，甚至可以降到2.0以下。目前，蛹蟲草菌發(fā)酵研究主要考察的是初始pH的影響。多數(shù)研究認(rèn)為控制酸性初始pH條件有利于蟲草素積累。Xie等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度28 ℃、初始pH 6.2為最優(yōu)發(fā)酵條件，生物量和蟲草素產(chǎn)量分別達(dá)到19.1 g/L和1.8 mg/g[45]。萬濤等考察了初始pH 2.0–10.0范圍內(nèi)菌體生長和蟲草素積累的變化，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基初始pH逐漸升高，生物量和蟲草素產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，蛹蟲草菌生長的最適初始pH在6.0左右，而蟲草素產(chǎn)量在pH 5.0時最高，達(dá)到264.0 mg/L[46]。Shih等也同樣發(fā)現(xiàn)菌體生長的最適初始pH在6.0左右，在pH 4.0–7.0初始pH范圍內(nèi)隨著初始pH逐漸升高，蟲草素產(chǎn)量逐漸降低，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為4.0，第25天發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量最高 (315.2 mg/L)，是pH 7.0條件下的2.28倍[27]。

1.3.3 光照

光照影響蛹蟲草子實體生長及次級代謝產(chǎn)物的積累。Dong等發(fā)現(xiàn)光源波長對菌絲生長、腺苷及蟲草素的生成有顯著影響。與藍(lán)光、白光和黑暗條件等相比，620–630 nm的紅光最適合菌絲生長和腺苷積累，但不適合蟲草素積累；而440–450 nm的藍(lán)光最適合蟲草素積累[48]，推測與藍(lán)光受體蛋白CmWC-1功能相關(guān)，此蛋白參與調(diào)控蛹蟲草子實體發(fā)育和次級代謝產(chǎn)物形成[50]。蛹蟲草菌液體培養(yǎng)經(jīng)LED藍(lán)燈 (440–450 nm) 照射 (16 h/d)，顯著促進了蟲草素的積累，第14天蟲草素產(chǎn)量達(dá)3.48 g/L，較對照組提高約58%[49]。

綜上所述，在蛹蟲草菌液體發(fā)酵體系，通過調(diào)控溶氧、pH、光照等培養(yǎng)條件能夠顯著提高蟲草素產(chǎn)量。與碳、氮源利用相似，細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累的最適溶氧、pH、光照條件不一致?；诖耍瑧?yīng)用兩步法液體發(fā)酵策略有利于提高蟲草素產(chǎn)量，即發(fā)酵前期，選擇葡萄糖、蛋白胨 (或酵母浸粉) 作為碳、氮源，控制高DO (50%–60%)、弱酸性pH (pH 6.0)、紅光光照 (620–630 nm)，促進菌體生長；發(fā)酵后期，選擇木糖 (或植物油)、銨鹽作為碳、氮源，控制低DO (0–30%)、酸性pH (pH 4.0)、藍(lán)光光照 (440–450 nm)，強化蟲草素積累。

2 蟲草素的分離純化

蟲草素來源不同，提取方法也有一定的差別。目前生物法獲取蟲草素可通過蛹蟲草子實體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵兩種形式。對于子實體培養(yǎng)而言，子實體和固體培養(yǎng)基殘基均需用于蟲草素分離；對于液體發(fā)酵系統(tǒng)，研究表明超過50%的蟲草素存在于發(fā)酵液中[24,40,52]。因此，對發(fā)酵液中的蟲草素進行分離純化就可回收大部分目的產(chǎn)物。

用于蟲草素分離的方法有浸提法、熱回流法、超聲波提取法[53-54]、微波提取法[55]、超臨界流體萃取法[56]、樹脂吸附法、制備色譜法[57]等，其中浸提法、熱回流法、超聲波/微波提取等溶劑萃取法主要應(yīng)用于子實體和固體培養(yǎng)基殘基中蟲草素的分離。

在液體發(fā)酵體系，Masuda等采用結(jié)晶法從蛹蟲草菌突變株G81-3培養(yǎng)液中分離純化蟲草素。發(fā)酵液首先經(jīng)過凍干，在室溫條件下制備蟲草素的濃縮液 (pH 2.7，蟲草素含量約40 g/L)，通過降低溫度或調(diào)節(jié)pH，均能得到蟲草素晶體，回收率為79.8%，純度為99.4%[58]。此方法具有簡單易行、不依賴于復(fù)雜設(shè)備、成本低等優(yōu)點，但需要制備較高濃度的蟲草素濃縮液。

大孔吸附樹脂吸附方法也可用于蟲草素分離，具有工藝簡單、綠色環(huán)保、高效安全的特點，可滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。李從鎮(zhèn)等從多種大孔樹脂中篩選出最合適蟲草素分離的NAK-II大孔樹脂，其吸附量可達(dá)到16.5 mg/g，解析率可達(dá)95%[59]。Ni等設(shè)計了一種循環(huán)式大孔樹脂柱層析萃取法，使用3種不同層析柱組成的循環(huán)柱層析萃取系統(tǒng)，萃取廢棄培養(yǎng)基中的蟲草素回收率可達(dá)97.24%[60]。Zhang等采用NKA-Ⅱ大孔樹脂吸附法分離子實體中蟲草素、N6-(2-羥乙基)-腺苷(HEA) 和腺苷，通過大孔樹脂吸附制備的粗品含有3.4%的蟲草素、3.7%的HEA和4.9%的腺苷，通過循環(huán)高速逆流色譜進一步純化粗品，在一步分離中從500 mg粗制樣品中獲得3種核苷，包括15.6 mg蟲草素、16.9 mg HEA和23.2 mg腺苷，其純度分別為98.5%、98.3%和98.0%[61]。

利用大孔樹脂實現(xiàn)發(fā)酵-分離耦合則為蟲草素高效生產(chǎn)提供了新思路?；诟邼舛认x草素對其生物合成過程產(chǎn)生強烈反饋抑制，關(guān)海晴等提出應(yīng)用發(fā)酵分離耦合技術(shù)移除部分蟲草素、弱化反饋抑制，在30 g/L葡萄糖的分批發(fā)酵體系中，經(jīng)過兩次NKA-Ⅱ大孔樹脂吸附，發(fā)酵21 d后蟲草素產(chǎn)量達(dá)到644.50 mg/L，較對照組提高32.07%[62]。

具有高選擇性的分子印跡技術(shù)也成功應(yīng)用于蟲草素分離。Zhang等以甲基丙烯酸和丙烯酰胺作為分子印跡聚合物 (Molecularly imprinted polymers，MIPS) 的功能單體，以改性硅膠為內(nèi)核，以蟲草素為模板，以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，制成MIPS。經(jīng)測試該MIPS最大蟲草素吸附量為95.37 mg/g，使用MIPS從蛹蟲草發(fā)酵液中分離蟲草素，蟲草素回收率為25.67%，純度為98%[63]。分子印跡分離技術(shù)可以特異性吸附蟲草素，而不受其他雜質(zhì)的干擾，有助于區(qū)分腺苷、2′-脫氧腺苷等結(jié)構(gòu)類似物，但此方法需要大量有機溶劑，且合成MIPS過程復(fù)雜，應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)尚有一定困難。

3 蟲草素生物合成途徑

3.1 蟲草素生物合成基因簇

自1950年蟲草素發(fā)現(xiàn)以來[1]，由于缺乏基因組相關(guān)信息，其生物合成途徑遲遲未被解析，直到2011年才由中國科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所Zheng等完成蛹蟲草菌的全基因組測序[64]。

此前，Kaczka等發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉中也能產(chǎn)生蟲草素[17]，Xia等推斷蛹蟲草菌和構(gòu)巢曲霉中必定共同存在負(fù)責(zé)蟲草素合成的關(guān)鍵基因[16]。Xia等通過比較蛹蟲草菌和構(gòu)巢曲霉基因組，發(fā)現(xiàn)了幾個高度同源的蛋白編碼基因，且緊密排列形成一個基因簇，蛹蟲草菌中分別是1、2、3和4，對應(yīng)構(gòu)巢曲霉中的同源基因分別是1、2、3和4。蛋白質(zhì)功能分析顯示1編碼氧化還原酶，2編碼金屬離子依賴的磷酸水解酶，3編碼ATP依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶，4編碼一個ABC型的轉(zhuǎn)運蛋白[16]。2019年Zhao等通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析九州蟲草 (Kob) 也發(fā)現(xiàn)了高度同源的蟲草素生物合成基因簇1-4[18]。

Xia等通過組合敲除基因1-4，并在釀酒酵母及羅伯茨綠僵菌中異源表達(dá)了1–4，結(jié)果表明1和2是蟲草素生物合成的關(guān)鍵基因，3基因參與噴司他汀的生物合成，4可能編碼噴司他汀的轉(zhuǎn)運蛋白[16]。1和2編碼蛋白在胞內(nèi)形成蛋白復(fù)合體且定位于脂滴。蟲草素在胞內(nèi)可被腺苷脫氨酶 (Adenosine deaminase，ADA) 催化脫毒去除氨基生成無細(xì)胞毒性的3′-脫氧肌苷，噴司他汀可通過抑制ADA的活性調(diào)控蟲草素合成。因此，噴司他汀被認(rèn)為是平衡細(xì)胞毒性和蟲草素積累水平的關(guān)鍵因素[16]。蛹蟲草菌蟲草素合成基因簇的揭示為闡述蟲草素合成機理、對關(guān)鍵靶點進行代謝工程改造和利用合成生物學(xué)方法高效生產(chǎn)蟲草素奠定了堅實基礎(chǔ)。雖然4不負(fù)責(zé)蛹蟲草中蟲草素的分泌運輸，但研究表明液體發(fā)酵體系中大部分蟲草素均存在于發(fā)酵液中[24,40,52]，表明蛹蟲草菌可能存在未知的特異性蟲草素轉(zhuǎn)運蛋白。

3.2 蟲草素生物合成途徑

蟲草素生物合成途徑的揭示經(jīng)歷了曲折的過程。自蟲草素被發(fā)現(xiàn)后，Kredich等利用碳同位素示蹤法對蟲草素的生物合成進行了探究，起初認(rèn)為蟲草素是由細(xì)胞預(yù)先合成的蟲草糖 (3′-脫氧核糖) 和腺嘌呤通過糖苷鍵聚合而成[65]。然而，多位科學(xué)家通過同位素示蹤實驗提出一種截然不同的觀點，認(rèn)為蟲草素的合成是以腺苷或其他衍生物為前體，在合成過程中糖苷鍵不發(fā)生斷裂[66-68]，且添加腺嘌呤或腺苷等前體物質(zhì)能顯著提高蟲草素產(chǎn)量[19,29,33]。由于細(xì)胞內(nèi)普遍存在腺苷及其衍生物，通過同位素標(biāo)記難以精確定位中間代謝物，示蹤蟲草素的生物合成途徑難度較大。

隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Li等基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析預(yù)測了蟲草素的生物合成途徑 (圖2棕色標(biāo)記路徑)，認(rèn)為蟲草素是以腺苷為前體，首先在腺苷激酶(ADK) 作用下通過磷酸化生成腺苷單磷酸 (AMP)，進而在腺苷酸激酶 (ADEK) 的作用下生成了腺苷二磷酸 (ADP)，并且在高度保守的核苷酸還原酶 (RNRs) 亞基作用下生成3′-dADP和2′-dADP，3′-dADP在腺苷酸激酶 (ADEK) 的作用下生成3′-dAMP，最終通過5′-核苷酸酶 (NT5E) 生成3′-脫氧腺苷 (蟲草素，COR)[69]。而2′-dADP經(jīng)過類似的反應(yīng)最終生成了2′-脫氧腺苷參與核酸代謝[70-71]。

圖2 蟲草素合成途徑預(yù)測[16,70]

然而，Kato等通過在大腸桿菌中異源表達(dá)蛹蟲草菌來源的核苷酸還原酶 (RNRs) 的大小亞基CmR1和CmR2，發(fā)現(xiàn)其僅催化由ADP生成2′-dADP的反應(yīng)，不參與催化ADP生成3′-dADP的反應(yīng)，表明在蛹蟲草菌中RNR不參與蟲草素生物合成[72]，說明蟲草素合成依賴其他代謝途徑。

隨著蛹蟲草菌基因組全測序工作的完成，Xia等基于比較基因組分析，進一步提出了新的蟲草素生物合成路徑 (圖2藍(lán)色標(biāo)記路徑)，認(rèn)為腺苷首先經(jīng)過特異的ATP依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶 (3編碼) 將3′-OH磷酸化生成3′-AMP，進而3′-AMP在金屬離子依賴的磷酸水解酶 (2編碼) 作用下去磷酸化形成不穩(wěn)定的烯醇化合物，通過自發(fā)異構(gòu)形成2-羰基-3-脫氧腺苷，最終在氧化還原酶 (1編碼) 作用下生產(chǎn)蟲草素。Xia等提出蟲草素代謝與噴司他汀(PTN) 的合成相關(guān)聯(lián)，PTN通過抑制腺苷脫氨酶 (ADA) 活性而避免蟲草素脫氨，胞內(nèi)PTN水平是調(diào)節(jié)蟲草素合成的關(guān)鍵因素[16,73]。

4 結(jié)論和展望

蛹蟲草作為中國傳統(tǒng)的中藥材，可開發(fā)其生物活性物質(zhì)用于食品、藥品及化妝品行業(yè)[3,74-76]。隨著上世紀(jì)50年代其重要活性成分蟲草素的發(fā)現(xiàn)，學(xué)術(shù)界開展了大量蟲草素合成及其藥用功能的研究，巨大的市場需求亟需開發(fā)蟲草素高效生產(chǎn)技術(shù)。雖然蛹蟲草人工培育技術(shù)成熟，但固體培養(yǎng)周期長、空間利用率低、操作復(fù)雜，因此目前液體發(fā)酵已發(fā)展成為蟲草素的重要生產(chǎn)手段，國內(nèi)外學(xué)者對此開展了大量培養(yǎng)基和工藝條件優(yōu)化研究，建立了一系列提高蟲草素產(chǎn)量的過程工程策略，如前體添加、銨鹽補料、光照調(diào)節(jié)等。

由于蟲草素是次級代謝產(chǎn)物，可以考慮采用分階段控制發(fā)酵過程，即前一階段實現(xiàn)生物量的積累，后一階段主要實現(xiàn)蟲草素的積累，兩段的培養(yǎng)基組成、光照條件、pH、DO等可以各不相同。

同時，蟲草素高效生產(chǎn)僅僅靠發(fā)酵工藝優(yōu)化也是不夠的，還需要在上游菌株改造及下游產(chǎn)品分離純化方面開展研究。雖然有許多關(guān)于蟲草素提取分離的報道，但多數(shù)研究是以蛹蟲草子實體為對象，缺少在液體發(fā)酵體系建立的高效分離工藝。對于具有細(xì)胞毒性的蟲草素發(fā)酵，開發(fā)原位發(fā)酵-分離耦合工藝可及時解除產(chǎn)物抑制、降低細(xì)胞毒性、提高細(xì)胞存活率，最終提高蟲草素產(chǎn)量[62-63]。

由于缺乏蛹蟲草菌的遺傳信息，早期高產(chǎn)菌株的選育主要是通過物理或化學(xué)誘變得到，但隨著蛹蟲草菌基因組序列解析[64]，以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等多種組學(xué)研究的開展[42,51,77-79]，蟲草素生物合成途徑逐漸清晰，確定了負(fù)責(zé)蟲草素合成的關(guān)鍵基因1和2，研究認(rèn)為1和2蛋白產(chǎn)物形成復(fù)合體參與蟲草素合成[16]，但具體催化機制有待進一步解析。

菌種的分子改造往往受限于沒有合適的遺傳操作系統(tǒng)，包括合適的載體系統(tǒng)、DNA胞內(nèi)遞送方法等。近年來蛹蟲草菌的分子改造技術(shù)也逐漸成熟，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)及原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體 系[80-81]、基于Split?Marker重組技術(shù)開發(fā)的基因敲除系統(tǒng)等[82]。此外，Chen等首次在蛹蟲草菌中成功開展了CRISPR-Cas9基因編輯工作[83]，為蛹蟲草菌的基因工程改造提供了更為高效快捷的技術(shù)手段。借助組學(xué)分析差異表型，甄選影響蟲草素生物合成的關(guān)鍵基因，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進行改造，將大幅度提高蛹蟲草菌蟲草素生產(chǎn)能力。

近年來合成生物學(xué)研究發(fā)展迅速，在原核或真核底盤細(xì)胞中構(gòu)建外源生物合成途徑，已經(jīng)成功實現(xiàn)了多種次級代謝物的高效生產(chǎn)[84-86]，筆者所在研究組也將蟲草素合成關(guān)鍵基因成功在釀酒酵母和畢赤酵母中表達(dá)并合成了蟲草素。將合成生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蟲草素的高效生產(chǎn)，需要優(yōu)化底盤生物代謝通量、緩解產(chǎn)物的細(xì)胞毒性、提高產(chǎn)物胞外轉(zhuǎn)運效率等，再結(jié)合過程工程策略、優(yōu)化菌種-發(fā)酵-分離的各個環(huán)節(jié)，將真正實現(xiàn)蟲草素的高效大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

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Advances in biosynthesis of cordycepin from

Xingyue Zhao1, Qian Li2, Wenjing Liu1, Haiqing Guan1, Cheng Li1, Jihui Wang1,3, and Liang Wang1

1,,116034,,2,,116622,,3,,523808,,

Cordycepin as the main active ingredient of, a traditional medicinal fungus in China, has many physiological functions such as anti-cancer, anti-tumor and anti-virus activity. The most potential route for effective cordycepin production has been considered as liquid fermentation ofthough with low productivity at present. Thus, it is urgent to apply both process engineering strategy and metabolic engineering strategy to enhance the productivity of cordycepin. In this review, the effects of medium components (i.e. the carbon/nitrogen source, precursor substances and metal ions) and operation factors (i.e. pH, dissolved oxygen and light) on cordycepin biosynthesis in liquid fermentation system are summarized. Besides, separation of cordycepin, the gene cluster involved and predicted biosynthesis pathways of cordycepin are also discussed, providing possible solutions of finally realizing efficient production of cordycepin.

cordycepin,, liquid fermentation, biosynthesis pathway, efficient production

10.13345/j.cjb.190500

November 11, 2019;

March 3, 2020

Supported by:National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFC1406800), Science and Technology Innovation Foundation of Dalian, China (No. 2019J12SN59), Natural Science Foundation of Liaoning, China (No. 2019-ZD-0575), Science Research Foundation of Educational Department of Liaoning Province, China (No. J2020102).

Liang Wang. Tel: +86-411-86324050; Fax: +86-411-86323646; E-mail: wangliang@dlpu.edu.cn

Jihui Wang. Tel: +86-411-86324050; Fax: +86-411-86323646; E-mail: wangjh@dlpu.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃 (No. 2018YFC1406800)，大連市科技創(chuàng)新基金 (No. 2019J12SN59)，遼寧省自然科學(xué)基金 (No. 2019-ZD-0575)，遼寧省教育廳科研項目 (No. J2020102) 資助。

趙星月, 李倩, 劉文靜, 等. 蛹蟲草菌生物合成蟲草素的研究進展. 生物工程學(xué)報, 2020, 36(7): 1293–1304.

Zhao XY, Li Q, Liu WJ, et al. Advances in biosynthesis of cordycepin from. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1293–1304.

(本文責(zé)編 郝麗芳)