聶 晶，王 鶴，楊 松，張志光，康曉明

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)宏大醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

腎臟纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是各種致病因素導(dǎo)致的正常腎臟細(xì)胞壞死、凋亡，因腎臟再生能力較差，大量間質(zhì)細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，引起的病理過(guò)程，是慢性腎病的最終病理類型[1，2]。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞的活化增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及正常腎臟組織被纖維化組織所代替是纖維化主要的病理學(xué)改變，多種細(xì)胞因子參與RIF的進(jìn)展，其中TGF-β1 /Smad3為RIF的共同通路。福辛普利作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，用于高血壓及心衰的治療，有研究表明，該藥物可以通過(guò)升高TGF-β1 /Smad3通路上游蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮延緩腎臟纖維化的作用，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。因此，通過(guò)福辛普利對(duì)UUO大鼠腎組織TGF-β1 /Smad3表達(dá)的影響，為臨床延緩腎間質(zhì)纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠Smad3抗體、山羊抗兔生物素標(biāo)記IgG( 購(gòu)買于武漢博士德生物工程有限公司) 、DAB顯色試劑盒、抗原修復(fù)液Ⅰ、SABC免疫組化試劑盒、MASSON染色試劑盒(購(gòu)買于武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制作

將72只健康清潔的 Wistar 雄性大鼠隨機(jī)均分為3組:Sham組、UUO組、福辛普利組，每組24只。其中UUO組及福辛普利組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎。Sham組大鼠僅鈍性剝離輸尿管，不結(jié)扎及剪斷輸尿管，其余處理同前。藥物治療組(福辛普利組)每日給予福辛普利(30mg/kg·d溶于2mL生理鹽水制成懸液灌胃)，Sham組及UUO模型組對(duì)應(yīng)給予2mL生理鹽水灌胃。

1.3 標(biāo)本收集、處理及測(cè)定

各組大鼠在分別于術(shù)后第3d、7d、14d隨機(jī)抽取8只大鼠處死。處死前采5mL靜脈血，離心后行血尿素氮和肌酐檢測(cè)。摘取左側(cè)腎臟多聚甲醛固定，將各組腎臟組織行梯度脫水，透明處理及石蠟包埋，蠟塊切片3μm，制成病理切片，行HE染色、Masson染色和免疫組化檢測(cè)。

1.4 Masson染色及免疫組化結(jié)果判定

1.4.1 Masson染色

將Masson染色后的切片置于光鏡下觀察，400倍鏡下觀察Masson的結(jié)果，腎小管上皮細(xì)胞漿及細(xì)胞核呈紫紅色的為陽(yáng)性，選取10個(gè)不同視野，參考文獻(xiàn)[4]方法評(píng)估腎小管間質(zhì)損傷程度，用RIF指數(shù)評(píng)分表示。

1.4.2 免疫組化

將免疫組化染色的切片在在400倍光鏡下觀察免疫組化的結(jié)果，視野內(nèi)表現(xiàn)為棕黃色的顆粒為染色陽(yáng)性指標(biāo)。隨機(jī)觀察10個(gè)不同視野，利用圖像分析系統(tǒng)分析兩組腎組織陽(yáng)性染色( 棕黃色顆粒) 的平均光密度，用AOD表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 生化分析

對(duì)比Sham組3d、7d、14d大鼠血BUN、Scr未見(jiàn)明顯異常(P>0.05)。對(duì)比UUO組及Sham組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，UUO組大鼠血BUN、Scr明顯升高，且隨著梗阻時(shí)間逐漸加重，呈現(xiàn)正相關(guān)，福辛普利組大鼠血 BUN、Scr較UUO組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各指標(biāo)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組生化指標(biāo)

2.2 Masson染色

Masson染色顯示sham組大鼠3d、7d、14d腎組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，間質(zhì)基本無(wú)綠染。與sham組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，UUO組大鼠腎組織隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，間質(zhì)膠原纖維逐漸綠染，腎小管上皮細(xì)胞漿及細(xì)胞核逐漸呈現(xiàn)紫紅色，腎小管變形逐漸加重，腎小管上皮細(xì)胞逐漸萎縮、變性、壞死。見(jiàn)圖1～4。

圖1 正常腎組織(10×40)

圖2 UUO組3d(10×40)

圖3 UUO組7d(10×40)

圖4 UUO組14d(10×40)

2.3 免疫組化

2.3.1 三組實(shí)驗(yàn)大鼠TGF-β1在腎組織的表達(dá)

鏡下觀察，Sham組各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1幾乎不表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞中無(wú)棕黃色顆粒，與Sham組相比，UUO組TGF-β1高表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)較多棕黃色顆粒，且梗阻時(shí)間越長(zhǎng)，棕黃色顆粒越多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；與UUO組大鼠對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，福辛普利治療組TGF-β1表達(dá)減少，腎小管上皮細(xì)胞棕黃色顆粒減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。

2.3.2 三組實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織Smad3的表達(dá)

鏡下觀察，Sham組大鼠腎組織內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)Smad3僅呈現(xiàn)微量表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞中未見(jiàn)明顯棕色顆粒；UUO組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腎組織Smad3表達(dá)較Sham組增加明顯，且隨著梗阻時(shí)間的增加棕色顆粒逐漸增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與UUO組相較，福辛普利組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)Smad3表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3表達(dá)情況

3 討論

福辛普利作為第一個(gè)含磷的血管緊張素(AngⅡ)轉(zhuǎn)換酶抑制劑，臨床上主要用于治療慢性高血壓及心力衰竭，有研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶參與高血壓腎臟損害及腎臟纖維化的全過(guò)程,在腎臟疾病的進(jìn)展中起重要作用，通過(guò)阻斷血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，降低血漿和組織中AngⅡ的生成，下調(diào)TGF-β1，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制物(TIMPs)系統(tǒng)，減輕腎間質(zhì)纖維化程度。TGF-β是一種具有多種功能及生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[5]。其中TGF-β1在腎臟中高表達(dá)，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是腎纖維化中最主要的激活及調(diào)控通路，TGF-β1與細(xì)胞受體結(jié)合后活化Smad3，通過(guò)核膜進(jìn)入核內(nèi)直接與DNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)促纖維化的作用[6]。在體外培養(yǎng)小鼠腎細(xì)胞的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白能夠減弱TGF-β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的靶基因活化及Smad3磷酸化，減輕腎纖維化；本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在UUO組，TGF-β1/Smad表達(dá)上調(diào)，福辛普利組TGF-β1/Smad表達(dá)下調(diào)，考慮福辛普利可能通過(guò)抑制TGF-β1∕Smad3通路的表達(dá)，發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用，既往有研究表明，Klotho蛋白可以抑制腎血管鈣化、抗氧化應(yīng)急和抑制腎臟纖維化，但是具體機(jī)制尚不詳盡，國(guó)內(nèi)外研究較少，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可以再今后的實(shí)驗(yàn)中加入對(duì)Klotho的研究，可能為腎纖維化的臨床治療及研究提供新的作用靶點(diǎn)及理論依據(jù)。