孫亞云 ，王若凡 ，張娟

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：食管癌是世界范圍內(nèi)第七大惡性腫瘤，居癌癥相關(guān)死亡原因第六位[1]。食管癌是我國第六大惡性腫瘤，居癌癥相關(guān)死亡原因第四位[2]。最新發(fā)布的2020年消化系統(tǒng)癌癥預(yù)估新發(fā)病例及死亡病例中，食管癌分別位于第六位、第四位[3]。西醫(yī)治療食管癌主要是通過手術(shù)、放療、化療、介入等方式，中醫(yī)則主要通過口服中藥湯劑達(dá)到治療效果。食管癌屬于中醫(yī)“噎膈”、“噎塞”等范疇。多數(shù)食管癌患者在發(fā)病早、中期已有血瘀表現(xiàn)，部分患者的血瘀癥狀則貫穿于發(fā)病始終。通幽湯作為活血通幽的經(jīng)典代表方劑，臨床上應(yīng)用廣泛。目前，針對通幽湯，無論是臨床觀察還是實驗研究，都尚未明確指出其有效活性成分、體內(nèi)作用靶點和作用機(jī)制。食管癌的高發(fā)病率、高死亡率及通幽湯治療食管癌的有效性都要求我們應(yīng)進(jìn)一步探索通幽湯治療食管癌的作用機(jī)理。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺的系統(tǒng)、完整構(gòu)建，為我們尋求通幽湯治療食管癌的作用機(jī)理提供了契機(jī)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)適用于中藥多成分、多靶點、多通路特點，對藥物、基因和疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，了解中藥及其復(fù)方的作用機(jī)制，全面深入探究中藥與機(jī)體的相互作用關(guān)系[4]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺探討通幽湯治療食管癌的主要成分、作用靶點及信號通路，為該方的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究使用軟件及在線工具

本研究使用的軟件見表1。

1.2 通幽湯有效成分篩選

本研究借助TCMSP數(shù)據(jù)庫[5]、TCMID數(shù)據(jù)庫[6]、Batman-TCM數(shù)據(jù)庫[7]結(jié)合文獻(xiàn)查找對通幽湯中藥味桃仁、紅花、生地黃、熟地黃、當(dāng)歸、升麻、甘草、檳榔進(jìn)行化學(xué)成分檢索。依據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%[8]、類藥性（DL）≥0.18[9]為條件進(jìn)行篩選。

1.3 通幽湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將收集得到的化學(xué)成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得化合物的預(yù)測蛋白靶點，利用UniProt數(shù)據(jù)庫[10]中UniProKBt的檢索功能將所有靶點名稱校正為官方名稱，建立“藥物-成分-靶點”數(shù)據(jù)信息庫。使用cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理，構(gòu)建通幽湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)并根據(jù)度值篩選活性成分。

表1 本次研究使用軟件及在線工具Table 1 Software and online tools were used in this study

1.4 食管癌相關(guān)靶點篩選

本研究借助genecards數(shù)據(jù)庫[11]，以“esophageal carcinoma”或“esophageal cancer”為關(guān)鍵詞，對食管癌相關(guān)靶點進(jìn)行收集并結(jié)合OMIM[12]、TTD[13]、DRUGBANK[14]數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點。根據(jù)經(jīng)驗，若靶點過多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點為食管癌的潛在靶點。將以上4個疾病數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并，去除重復(fù)值，作為食管癌的預(yù)測靶點庫。

1.5 “藥物-疾病”靶點映射

通過FUNRICH 3.1.3軟件“Add dataset”功能將藥物有效活性成分對應(yīng)靶點導(dǎo)入并命名為“成分靶點”，食管癌相關(guān)靶點導(dǎo)入并命名為“疾病靶點”，通過“Venn”功能進(jìn)行映射，獲得通幽湯治療食管癌的潛在作用靶點，繪制韋恩圖。

1.6 共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“藥物-疾病”共有靶點導(dǎo)入在線STRING平臺，限定研究物種為“Homo sapiens”、“minimum required interaction score（≥0.9）”并且隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到蛋白與蛋白相互作用信息，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。在“Exports”下保存其TSV格式文件，將文件中的node1，node2，combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)后，進(jìn)一步進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。節(jié)點表示靶點，邊表示蛋白與蛋白之間相互作用，combined score值反映邊的粗細(xì)，節(jié)點degree值反映靶點大小及顏色深淺。Combined score值由小到大，則邊由細(xì)到粗。Degree值由小到大，則節(jié)點由小到大，顏色由淺至深。同時采用MCODE算法進(jìn)行潛在蛋白質(zhì)功能模塊分析，將K-Core設(shè)置2，將結(jié)果顯示score大于2的模塊根據(jù)打分進(jìn)行聚類排序。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

Metascape平臺擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料[15]。將130個“藥物-疾病”共有靶點錄入Metascape平臺進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。限定“Min Overlap：3”、“P Value Cutoff：0.01”、“Min Enrichment：1.5”。其中GO富集分析包括分子功能（Molecular function，MF），細(xì)胞組分（Cellular component，CC）和生物過程（Biological process，BP）三個部分。查閱相關(guān)資料，對所得到的涉及靶點較多的通路進(jìn)行分析。借助EasyChar平臺對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.8 “通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將Metascape平臺KEGG通路富集分析得到的前20條KEGG通路與通幽湯活性成分及靶點信息按照網(wǎng)絡(luò)文件和屬性文件進(jìn)行excel文件格式的數(shù)據(jù)編排，上傳至Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。運用CytoScape 3.7.2內(nèi)置的“NetworkAnalyzer”工具分析成分、靶點、通路的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（Degree）、 介 度（Betweenness）、 緊 密 度（Closenesss）等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.9 核心基因預(yù)后分析與差異驗證

Kaplan Meie-plotter是一種常用的基于EGA、TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫的在線網(wǎng)站工具，用于評估基因?qū)ι嫫诘挠绊慬16]。設(shè)定癌種為“Esophageal Adenocarcinoma、 Esophageal Squamous Cell Carcinoma”，選取“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中靶點Degree值高于平均靶點Degree值的靶基因。將所得基因依次通過KM-plotter進(jìn)行生存分析。篩選出對食管癌總生存期（Overall Survival，OS）有影響的基因，將p值＜0.05的基因進(jìn)一步在GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行差異驗證。

2 結(jié)果

2.1 通幽湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

從TCMSP、TCMID、Batman-TCM數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中共獲取通幽湯8味藥161個活性成分，并查詢通幽湯化合物對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫將所有靶點名稱校正為官方名稱，刪除重復(fù)項后共預(yù)測靶標(biāo)251個。方中各藥味活性成分和預(yù)測靶標(biāo)數(shù)量見表2。使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理，構(gòu)建通幽湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)，如圖1。通過CytoScape 3.7.2內(nèi)置的“Network Analyzer”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯鶕?jù)度值篩選活性成分，度值排前10位的代表成分見表3。

2.2 食管癌相關(guān)靶點篩選

以“esophagealcarcinoma”為關(guān)鍵詞在genecards數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點6 107個，以“esophageal cancer”為關(guān)鍵詞在genecards數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點7055個。根據(jù)經(jīng)驗若靶點過多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點為食管癌的潛在靶點。如genecards中“esophageal carcinoma”Score最大值為154.61，最小值為0.2，中位數(shù)為2.54，則設(shè)定Score＞2.54的靶點為食管癌的潛在靶點。結(jié)合OMIM、TTD、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并4個數(shù)據(jù)庫后刪除重復(fù)值，最終得到1 378個食管癌相關(guān)靶點。

表2 通幽湯“中藥-成分-靶標(biāo)”基本信息Table 2 Basic information of common targets of Tongyou Decoction

表3 通幽湯的核心活性成分Table 3 Core active ingredients of Tongyou Decoction

圖1 通幽湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Network of Chinese medicine-active ingredients-prediction target of Tongyou Decoction

2.3 共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過FUNRICH3.1.3軟件“Add dataset”功能將成分靶點與疾病靶點經(jīng)“Venn”功能進(jìn)行映射，獲得通幽湯成分-食管癌共同靶點130個，如圖2。進(jìn)而將靶點提交至String數(shù)據(jù)庫，獲得STRING平臺共有靶點蛋白相互作用信息，如圖3-A。保存其TSV格式文件，將文件中的node1，node2，combined score信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件繪制蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，如圖3-B。進(jìn)一步進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，如圖3-C。該網(wǎng)絡(luò)共涉及125個節(jié)點，668條邊，網(wǎng)絡(luò)平均鄰居節(jié)點數(shù)為：10.688。共有48個靶蛋白Degree值高于平均值，其中AKT1、STAT3、TP53、JUN、MAPK1、MAPK3等靶點蛋白Degree值較大，表明與其他蛋白相互作用較強，因此這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。同時采用MCODE算法進(jìn)行潛在蛋白質(zhì)功能模塊分析，將K-Core設(shè)置2，結(jié)果顯示score大于2的模塊根據(jù)打分的排序聚成7類，分析得到AKT1、TP53、BCL2、CCNB1等58個基因。篩選結(jié)果見圖3-D。

圖2 活性成分靶點與食管癌靶點venn圖Figure 2 Venn diagram of active component target and esophageal cancer target

2.4 GO富集分析及KEGG通路富集分析

將130個關(guān)鍵靶蛋白導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析，借助EasyChar平臺對結(jié)果進(jìn)行可視化。其中生物過程（BP）涉及對無機(jī)物的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、脂質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組成（CC）涉及細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、囊泡腔等；分子功能（MF）涉及蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析涉及癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、弓形蟲病、丙型肝炎、p53信號通路、FoxO信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、NF-κB信號通路、化學(xué)致癌作用等。根據(jù)p值排序，每個模塊前10位的條目見圖4A-D。

圖3 PPI篩選網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 PPI screening network diagram

2.5 “通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

圖4 GO富集分析及KEGG通路富集分析Figure 4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

運用CytoScape3.7.2構(gòu)建“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，如圖5。網(wǎng)絡(luò)共涉及237個節(jié)點和1 322條邊。通過CytoScape 3.7.2內(nèi)置的“NetworkAnalyzer”功能分析通幽湯治療食管癌的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，并根據(jù)Degree值篩選通幽湯治療食管癌的關(guān)鍵成分及核心作用靶點。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析表明，槲皮素連接度（Degree）為148，介度（BetweennessCentrality）為 0.2 097 949，緊密度（ClosenessCentrality）為0.55 269 321，預(yù)測槲皮素為通幽湯治療食管癌的主要成分。其次為山柰酚（連接度為52，介度為0.03 152 119，緊密度為0.45 124 283）、木犀草素（連接度為38，介度為0.05 169 843，緊密度為0.47 294 589）、β-谷甾醇（連接度為33，介度為0.00 784 141，緊密度為0.42 369 838）。按度值排列前10位見表4。

PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為126，介度為0.31 799 445，緊密度為0.63 101 604，預(yù)測PTGS2為通幽湯治療食管癌的最主要靶點。HSP90AA1、PPARG、AR、NOS2、CDK2、GSK3B、MAPK14亦為相對重要靶點。根據(jù)p值進(jìn)行排序，靶標(biāo)通路富集結(jié)果前10位見表5。

2.6 核心基因預(yù)后分析與差異驗證結(jié)果

選取“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中靶點Degree值高于平均Degree值的靶點共17個，進(jìn)一步使用KM-plotter分析核心基因的預(yù)后信息，其中HSP90AA1、CDK2、AKT1、JUN與食管腺癌總生存期相關(guān)（P＜0.05），GSK3B、CHEK1、BCL2與食管鱗癌總生存期相關(guān)（P＜0.05），如圖6所示。進(jìn)一步在GEPIA在線數(shù)據(jù)庫對以上7個基因進(jìn)行食管癌癌組織與癌旁組織的差異表達(dá)驗證，結(jié)果顯示HSP90AA1、GSK3B、CHEK1基因在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（p＜0.05，紅色代表腫瘤組織，灰色代表癌旁組織），如圖7所示。

圖5 通幽湯成分-食管癌靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Tongyou Decoction composition-esophageal cancer target-pathway network

3 討論

通幽湯出自《蘭室秘藏》卷下，由桃仁、紅花、生地黃、熟地黃、當(dāng)歸、升麻、甘草、檳榔8味藥配伍而成。本方主治瘀血內(nèi)停，血燥津枯，幽門不通之證，具有養(yǎng)血活血，潤燥通幽的功效?，F(xiàn)代臨床研究表明，通幽湯或通幽湯聯(lián)合放化療、放射性125I粒子植入、中成藥等治療食管癌均能起到較好療效[17-21]。通幽湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)顯示：一味中藥可對應(yīng)多個化合物，同一化合物可調(diào)控不同靶點，顯示了通幽湯發(fā)揮作用是通過多成分、多靶點的協(xié)同作用。

表4 通幽湯治療食管癌的核心活性成分Table 4 The core active ingredients of Tongyou Decoction in the treatment of esophageal cancer

表5 靶標(biāo)通路富集結(jié)果Table 5 Enrichment results of target pathway

通幽湯治療食管癌的藥味及活性成分篩選：①藥味：前10位通幽湯治療食管癌的核心活性成分所對應(yīng)的17個藥味中，紅花占7味，占比約41%?；钚猿煞肿罡叩拈纹に厮鶎?yīng)的藥味亦為紅花。故初步推測紅花可能為通幽湯治療食管癌的關(guān)鍵藥味。臨床研究表明紅花提取物紅花黃色素可有效降低胸腔鏡食管癌根治術(shù)術(shù)后患者早期并發(fā)癥，減弱機(jī)體創(chuàng)傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善肺功能，提高臨床治療有效率[22]。②活性成分：根據(jù)Degree值進(jìn)行排序，槲皮素連接度最高，預(yù)測槲皮素為通幽湯治療食管癌的主要成分。其次為山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等，這與通幽湯預(yù)測的核心活性成分具有一致性。食管癌相關(guān)基礎(chǔ)研究表明，槲皮素可抑制人食管癌Eca109細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及血管新生，又可誘導(dǎo)人食管癌Eca109細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬、促進(jìn)其凋亡，呈時間和劑量依賴效應(yīng)[23-25]。山柰酚通過靶向EGFR信號通路抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖和糖酵解[26]。木犀草素可能通過誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡，參與caspase3、caspase9 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[27]。

圖6 KM-plotter分析Figure 6 KM-plotter analysis

圖7 GEPIA分析Figure 7 GEPIA analysis

通幽湯治療食管癌的靶點主要集中在PTGS2，HSP90AA1亦為重要靶點之一。臨床研究表明前列腺素過氧化物酶-2（PTGS2）的酶活性與炎癥和腫瘤生長相關(guān)，是一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物[28]。盡管使用KM-plotter對PTGS2進(jìn)行基因預(yù)后信息分析顯示：PTGS2與食管癌生存期無統(tǒng)計學(xué)意義，但回顧既往研究，PTGS2與食管癌的研究多集中在生存期方面，結(jié)論尚不相同，目前有：PTGS2的表達(dá)與食管癌的生存期無關(guān)[29]、PTGS2高表達(dá)不利于食管癌患者的生存[30]、PTGS2高表達(dá)與提高總體生存率和癌特異性生存率相關(guān)[31]等，故PTGS2能否作為食管癌預(yù)后性生物標(biāo)志物仍是未來需進(jìn)一步研究的方向。HSP90AA1與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，HSP90AA1下調(diào)表達(dá)使CE81T-4細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，促進(jìn)凋亡，抑制增殖、侵襲和遷移能力[32]。KM-plotter分析亦顯示HSP90AA1與食管癌總生存期相關(guān)，并且HSP90AA1在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。

PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及125個關(guān)鍵靶點，48個靶點Degree值高于平均值。使用MCODE算法，根據(jù)Cluster score值聚類排序進(jìn)行潛在蛋白質(zhì)功能模塊分析，score值最高的模塊涉及14個靶點，是最具有生物學(xué)意義的集合。該集合有2種含義，一為蛋白質(zhì)復(fù)合體，即多個蛋白質(zhì)共同組成復(fù)合體而后發(fā)揮生物學(xué)作用；二為功能模塊，即位于同一通路的蛋白質(zhì)，其相互作用更加密切[33]。PPI網(wǎng)絡(luò)亦表明通幽湯多靶點治療食管癌的特點。

通幽湯治療食管癌的通路主要集中在癌癥通路（hsa05200）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（hsa04933）、前列腺癌（hsa05215）等。鐘珊等[34]研究發(fā)現(xiàn)ESCC組織/細(xì)胞中顯著降低的miR-3914和miR-8082與癌癥通路相關(guān)，其余兩者與食管癌尚無相關(guān)研究。就中醫(yī)病因病機(jī)而言，食管癌、糖尿病、前列腺癌病機(jī)均有陰虛血瘀表現(xiàn)，治療上均可使用通幽湯[35-37]進(jìn)行治療，這充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治、異病同治的治療原則。就經(jīng)絡(luò)循行而言，前列腺癌、食管癌皆為足厥陰肝經(jīng)所循行，糖尿病則符合中醫(yī)“絡(luò)病”表現(xiàn)，絡(luò)脈亦可與肝經(jīng)相連，故三者經(jīng)絡(luò)循行相關(guān)。后續(xù)研究中可否通過陰虛血瘀的病因病機(jī)確定治則，使用針灸或穴位注射等方法治療疾病有待于進(jìn)一步研究探索。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析通幽湯治療食管癌的作用機(jī)制，結(jié)果表明通幽湯是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同來發(fā)揮治療食管癌的作用。預(yù)測的活性成分、靶點及通路與大部分文獻(xiàn)報道相一致，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法具有較高可信度，能為挖掘中藥潛在價值提供可靠平臺。對于該研究中未提及的化合物、靶點及通路，可能原因：一、本與食管癌發(fā)生、發(fā)展、治療機(jī)制不相關(guān)；二、相關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)。本研究現(xiàn)僅借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺、基于生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞學(xué)或動物學(xué)驗證，為臨床給藥提供可靠依據(jù)。