王雅軒，李冰潔，崔抗，余樸，馬望

鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

鴉膽子為苦木科（Simaroubaceae）鴉膽子屬（Brucea J.F.Miller）植 物 鴉 膽 子 [Brucea javanica（Linnaeus）Merrill]的干燥成熟果實，又名老鴉膽、苦參子和鴉蛋子，主產(chǎn)于我國廣東、廣西、海南、云南、福建和臺灣等地。鴉膽子化學成分非常復雜，其研究始于上世紀60年代初，迄今為止，已從鴉膽子種子和全草中分離鑒定了150多個化合物，其中主要包括苦木內(nèi)脂類、黃酮類、蒽醌類、三萜類、甾體類、脂肪酸類、倍半萜類等化合物[1]。我國于1978年開始研制鴉膽子油靜脈乳劑，并用于各種惡性腫瘤包括食管癌的治療[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳與其他抗癌藥共用時，有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，可以增強其他藥物對耐藥細胞的細胞毒作用[5]。然而，鴉膽子抗食管癌的特定機制和有效單體尚不明確。本研究利用生物信息學和網(wǎng)絡藥理學，結(jié)合中藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點，對鴉膽子治療食管癌的靶點及作用機制進行了分析，為鴉膽子應用于食管癌臨床提供理論依據(jù)，并為進一步的實驗研究和臨床應用提供思路。

1 材料與方法

1.1 鴉膽子有效成分及靶點的篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）進行鴉膽子有效成分及靶點的篩選[6]。TCMSP是一種獨特的中草藥系統(tǒng)藥理學平臺，其包含了499味草藥（中國藥典2010版）以及每位草藥的化合物成分（共計29000余個），并能捕捉藥物、靶標和疾病之間的關(guān)系。在獲得了有效成分以后，我們又以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18為篩選條件[7]，對鴉膽子的活性成分進行進一步的篩選。

1.2 食管癌相關(guān)靶點的提取

利用 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）進行食管癌相關(guān)靶點的提取。GeneCards是一個包含了150個網(wǎng)絡來源的以基因為中心的數(shù)據(jù)的集成數(shù)據(jù)庫，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、遺傳、臨床和功能信息，提供所有有關(guān)注釋和預測人類基因的全面信息。OMIM數(shù)據(jù)庫中包含有關(guān)所有已知孟德爾疾病和超過15 000個基因的信息，其關(guān)注于表型和基因型之間的關(guān)系。我們把從兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的相關(guān)靶基因取并集，得到食管癌相關(guān)靶點。

1.3 “有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

將鴉膽子有效成分的靶點和食管癌相關(guān)靶基因取交集，得到共同靶點基因。使用Cytoscape 3.7.1軟件，利用所得到的交集基因做出“有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖[8]。該網(wǎng)絡圖可以展示出鴉膽子有效成分和食管癌基因之間的關(guān)系。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡（protein protein interaction network，PPI network）的構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建靶蛋白的PPI網(wǎng)絡。STRING數(shù)據(jù)庫是一個搜索已知蛋白質(zhì)和預測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，包括了直接的物理作用和簡介的功能相關(guān)性。我們使用STRING數(shù)據(jù)庫來觀測靶基因蛋白之間的相互作用關(guān)系，并找出更為關(guān)鍵的核心基因。

1.5 富集分析

為了進一步的研究靶基因的分子機制，我們進行了基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）分析。GO功能分析可以從功能、生物途徑、細胞功能的角度對基因產(chǎn)物進行簡單注釋[9]。KEGG通路富集分析是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫，其中包含了基因的通路信息。其截斷鑒定標準均為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子成分及靶點篩選結(jié)果

通過使用TCMSP篩選出鴉膽子已知有效成分67種，通過OB≥30%、DL≥0.18條件進行篩選，獲得15個符合條件的有效成分（表1），其對應40個靶基因。

2.2 食管癌靶基因的獲取

我們在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別獲取了與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因靶點，取其交集，共有7 092個。

2.3 藥物-疾病靶點預測結(jié)果

將44個鴉膽子有效成分靶基因和7 092個食管癌靶基因取交集，獲得38個同時存與鴉膽子和食管癌相關(guān)的基因，對應了2種鴉膽子的有效成分，分別為木犀草素及β-谷固醇。我們使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建鴉膽子與食管癌相關(guān)的“有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖（圖1）。

表1 鴉膽子主要成分基本信息Table 1 Basic information of main components of Brucea javanica

圖1 鴉膽子與食管癌相關(guān)的“有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖Figure 1 Network diagram of“active ingredientstargets”related to Brucea javanica and esophageal cancer

2.4 靶蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡分析

把我們獲得的38個同時與鴉膽子和食管癌相關(guān)的靶基因利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡（圖2）。圖3展示的是靶基因蛋白之間的交互次數(shù)情況，其中次數(shù)越多，意味著靶基因在PPI網(wǎng)絡中起到更加關(guān)鍵的作用。由圖可知，PPI網(wǎng)絡圖中的核心 基 因 為 EGFR、 CASP3、 CCND1、 VEGFA、ERBB2、IL6。

圖2 鴉膽子作用于食管癌的PPI網(wǎng)絡圖Figure 2 PPI network diagram of Brucea javanica acting on esophageal cancer

圖3 靶基因蛋白交互情況圖Figure 3 Target gene protein interaction diagram

2.5 GO功能分析

我們利用R軟件，對38個鴉膽子和食管癌的交集靶基因進行了GO功能分析。共富集到了55個功能（P＜0.05），按P值從小到大排序前20個功能的情況見表2、圖4。圖表結(jié)果顯示，鴉膽子化合物主要富集的功能包括：泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、乙酰膽堿受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、BH域綁定、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型肽酶活性染色質(zhì)結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、死亡受體結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性、激素結(jié)合、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性。

2.6 KEGG通路富集分析

我們對38個基因做了KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示富集到了98條通路上（P＜0.05）。按P值從大到小排序前20條通路的情況見表3、圖5。圖表結(jié)果顯示，鴉膽子化合物主要富集的通路包括：前列腺癌、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、EB病毒感染、鉑耐藥、PI3K-Akt信號通路、凋亡-多種類、軍團菌病、細胞凋亡、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號通路、膀胱癌、p53信號通路、胰腺癌、甲型流感、麻疹、小細胞肺癌、丙型肝炎、非小細胞肺癌、HIF-1信號通路。

3 討論

《本草綱目拾遺》中記載“鴉膽子，出閩、廣，藥肆中皆有之。形如梧子，其仁多油，生食令人吐，作霜，捶去油，入藥佳”，并提出鴉膽子具有清熱解毒、截瘧、止痢、腐蝕贅疣的功效[10]。在現(xiàn)代醫(yī)學中，鴉膽子也被廣泛應用，尤其在抗腫瘤領(lǐng)域。其提取物鴉膽子油乳具有抗癌譜廣、毒性低、效果好等諸多優(yōu)點，且已廣泛用于多癌種的研究及治療[11]。在一項鴉膽子油乳注射液對晚期肝癌患者的臨床療效研究中顯示，其在晚期肝癌的治療方面發(fā)揮重要作用，具有應用前景和研究價值[12]。在食管癌的治療方面，有研究表明在食管癌同步放化療的過程中聯(lián)合運用鴉膽子油乳注射液，可減輕放化療治療的毒副反應，提高患者的生存質(zhì)量[4]。

表2 鴉膽子治療食管癌的關(guān)鍵靶點功能信息Table 2 Key target function information of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

圖4 GO功能分析柱狀圖Figure 4 GO function analysis histogram

表3 鴉膽子治療食管癌的關(guān)鍵靶點富集通路信息Table 3 Key target enrichment pathway information of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

圖5 鴉膽子治療食管癌的關(guān)鍵通路Figure 5 Key pathways of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

表皮生長因子受體（pidermal growth factor receptor，EGFR）為表皮生長因子受體，屬于受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）的酪氨酸激酶受體（ErbB）家族，在細胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它常在癌癥發(fā)生時突變或過表達，目前也為多種抗癌藥物的靶點基因之一[13-15]。半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）激活在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用，其突變與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)[16]。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）的蛋白產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)細胞周期，其突變、擴增和過表達可促進腫瘤的發(fā)生[17]。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的上調(diào)可促進腫瘤組織的血管生成，也可以影響腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能[18]。已有研究表明，酪氨酸激酶受體2（ERBB2）的擴增存在于15%～17%的食管癌中，其激活與食管癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。白細胞介素-6（Interleukin-6，IL6）是由多種類型的細胞產(chǎn)生的具有多種生物學功能的細胞因子，其與炎性疾病及腫瘤細胞的增殖有關(guān)，大量數(shù)據(jù)顯示其抑制劑可以治療炎性疾病及抑制癌細胞增殖[20]。我們猜測鴉膽子通過其含有的有效成分木犀草素及β-谷固醇，來調(diào)節(jié)EGFR、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、IL6等靶點的表達或抑制其突變，從而達到抑制食管癌生長的作用。這也表明了鴉膽子通過多成分、多靶點的作用特點治療食管癌。

鴉膽子活性成分與食管癌交集的靶基因的GO功能富集分析結(jié)果主要包括泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、乙酰膽堿受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、BH域綁定、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型肽酶活性染色質(zhì)結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、死亡受體結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性、激素結(jié)合、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性等。

在KEGG通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，鴉膽子治療食管癌的主要通路有前列腺癌、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、EB病毒感染、鉑耐藥、PI3K-Akt信號通路、凋亡-多種類、軍團菌病、細胞凋亡、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、膀胱癌、p53信號通路、胰腺癌、甲型流感、麻疹、小細胞肺癌、丙型肝炎、非小細胞肺癌、HIF-1信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路在調(diào)節(jié)細胞存活、生長、增殖、血管生成、轉(zhuǎn)錄、翻譯和代謝中起著至關(guān)重要的作用[21]，可以調(diào)節(jié)食管癌的發(fā)生與發(fā)展。p53信號通路在調(diào)控細胞周期、細胞凋亡表達等方面發(fā)揮著重要作用[22]，有研究表明通過調(diào)節(jié)p53信號通路可以抑制食管癌細胞增殖并誘導細胞周期G0/G1時期停滯[23]。HIF-1信號通路可由腫瘤內(nèi)缺氧的激活，其過表達與包括食管癌在內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移和較差的預后密切相關(guān)[24，25]。由通路富集分析可知，鴉膽子有效成分靶基因富集到的通路主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期、細胞凋亡、腫瘤內(nèi)血管生成來影響食管癌的發(fā)生發(fā)展及預后。

本文基于網(wǎng)絡藥理學及生物信息學，研究了鴉膽子治療食管癌的作用機制。我們通過PPI網(wǎng)絡分析聚焦核心基因，通過富集分析進一步分析其作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，中藥鴉膽子對食管癌的治療可通過多種有效成分及與食管癌相關(guān)靶基因和通路產(chǎn)生作用。本研究仍存在一些不足，如數(shù)據(jù)均從公開數(shù)據(jù)庫獲取，可能會存在內(nèi)容更新不及時及數(shù)據(jù)篩選不準確的缺點。本研究結(jié)論還需臨床及實驗結(jié)果驗證。