包櫻鈺 謝輝 陳呂軍 溫東輝,?

研究簡報

城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中4種抗生素抗性基因的沿程變化

包櫻鈺1謝輝2陳呂軍2溫東輝1,?

1.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 100871; 2.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100084; ?通信作者, E-mail: dhwen@pku.edu.cn

為探究抗生素抗性基因(ARGs)在城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中的沿程變化, 針對 4 種關(guān)注度較高的 ARGs (,,和bla)和 I 型整合子的整合酶基因(), 選取京津冀地區(qū)一座中小城鎮(zhèn)的污水處理廠, 使用普通 PCR 和實時熒光定量 PCR 技術(shù), 對各工藝單元的水樣進(jìn)行細(xì)胞內(nèi) ARGs 和的定性及定量檢測分析。結(jié)果表明, 4 種 ARGs 和普遍存在于城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中, 出水中 ARGs 和的絕對豐度降低, 去除量在 1.26~2.30logs 之間。相關(guān)性分析表明,和水質(zhì)因子(pH, COD和NH3-N)可能與 4 種 ARGs 的傳播擴(kuò)散有關(guān)。

抗生素抗性基因(ARGs); 城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng); A2/O工藝; 實時熒光定量PCR

由于環(huán)境選擇壓力(抗生素、重金屬等)的存在, 抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)得以迅速在環(huán)境中產(chǎn)生與傳播[1]。與化學(xué)污染物不同, ARGs 具有遺傳復(fù)制、水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)等生物學(xué)特性[2–3], 一旦進(jìn)入環(huán)境就很難控制和消除。因此, 近年來 ARGs 成為備受矚目的一種新型污染物。研究表明, ARGs 在常規(guī)的城鎮(zhèn)污水處理廠進(jìn)、出水中普遍存在[4–5]。城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中的抗生素、重金屬、可移動遺傳元件(mobile genetic elements, MGEs)和微生物等可能對ARGs 的形成、水平轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散起到促進(jìn)作用[6]。因此, 對城鎮(zhèn)污水處理廠中 ARGs 賦存特征和去除效果展開研究十分必要。

京津冀地區(qū)是我國北方經(jīng)濟(jì)的重要核心區(qū), 人口密集, 是抗生素排放強(qiáng)度較大的區(qū)域之一[7], 存在潛在的 ARGs 污染風(fēng)險。本研究選取京津冀地區(qū)典型中小城鎮(zhèn)的污水處理廠, 采集沿程各工藝單元水樣進(jìn)行 ARGs 的定量檢測分析, 揭示城鎮(zhèn)污水處理過程中 ARGs 的賦存情況, 為京津冀地區(qū) ARGs污染的防控提供參考。

1 ARGs 和基本理化指標(biāo)的測定

選取河北省一座生活污水處理廠為研究對象, 圖 1 展示其污水處理工藝流程及采樣點位(圓圈表示)。樣品采集后, 立即進(jìn)行理化指標(biāo)和 ARGs 的定量分析。分別采用電極法[8]、重鉻酸鹽法[8]、納氏試劑分光光度法[8]和鉬酸銨分光光度法[8]測定樣品的 pH, COD, NH3-N 和 TP, 結(jié)果見表 1。對樣品進(jìn)行 DNA 提取后, 使用普通 PCR 和實時熒光定量PCR(qPCR)的 SYBR Green I 方法, 對,,和bla4 種 ARGs 以及 I 型整合子的整合酶基因分別進(jìn)行定性和定量分析, 操作流程見文獻(xiàn)[9]。此外, 對 16S rDNA 進(jìn)行定量測定, 作為微生物總量的表征值。

表1 樣品理化指標(biāo)分析結(jié)果

說明: ―表示未測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 污水處理系統(tǒng)中ARGs 的分布特征

2.1.1 ARGs絕對豐度

圖 2(a)顯示目標(biāo)基因在污水處理系統(tǒng)各單元中的分布情況, 4 種 ARGs 和在全部水樣中均有檢出, 表明它們普遍存在于污水處理系統(tǒng)中。總進(jìn)水中的絕對豐度最高, 目標(biāo)基因絕對豐度分布在 5.50×105~9.93×107copies/mL 之間。,,bla和的絕對豐度沿處理工藝流程大致呈降低趨勢。消毒工藝出水中,,bla和的絕對豐度顯著升高, 與 Yoon 等[10]的研究結(jié)果一致。

進(jìn)入 A2/O 處理單元后,的絕對豐度顯著升高, 在厭氧區(qū)達(dá)到最大值。經(jīng)過二次沉淀,的絕對豐度進(jìn)一步增加, 是絕對豐度最高的 ARGs; 經(jīng)過絮凝沉淀和消毒后, 出水中的絕對豐度顯著降低。

在總出水中, 目標(biāo)基因的絕對豐度排序為>>>>bla, 在 3.40×103~3.05×106copies/mL 之間, 所有 ARGs 和在出水中的絕對豐度顯著低于進(jìn)水。

2.1.2 ARGs相對豐度

圖 2(b)顯示目標(biāo)基因在污水處理系統(tǒng)各單元中的相對豐度(即目標(biāo)基因與 16S rDNA 拷貝數(shù)之比)。對比圖 2(a)與(b)可知, ARGs 及在絕對豐度和相對豐度上的變化趨勢不同。這是由單位體積水樣的微生物量差異引起的[11], 僅關(guān)注絕對豐度無法體現(xiàn) ARGs 在微生物基因組中的占比情況, 因此對ARGs 及的相對豐度進(jìn)行分析十分必要。

總進(jìn)水中各目標(biāo)基因的相對豐度在 10?5~10?2之間, 與絕對豐度結(jié)果一致, 進(jìn)水中相對豐度最高的為。,,bla與的相對豐度變化趨勢大致相同: 經(jīng)過細(xì)格柵和旋流沉砂池、A2/O 各處理階段, 上述基因在微生物群落基因組中的占比逐漸下降; 經(jīng)過二次沉淀、絮凝沉淀和消毒后, 相對豐度呈上升趨勢。相對豐度的變化趨勢與上述基因有較大的差異。在 A2/O 的厭氧區(qū)中,相對豐度升高。經(jīng)過二次沉淀和絮凝沉淀,相對豐度呈上升趨勢。消毒處理后,相對豐度降低, 但仍顯著高于總進(jìn)水。

總出水中, 目標(biāo)基因的相對豐度分布在 6.76× 10?5~5.71×10?2之間,,和的相對豐度高于進(jìn)水, 說明污水處理后, 這幾類基因在微生物群落基因組中的占比增大。有研究證明, 污水處理系統(tǒng)是受納水體下游 ARGs 的主要來源[12–13], 因此城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)對于受納地表水的ARGs輸入及其生態(tài)風(fēng)險不容小覷。

2.2 污水處理系統(tǒng)對 ARGs 和 intI1 的去除效果

圖 3 顯示各污水處理單元及污水處理全程對目標(biāo)基因的去除情況。不同工藝單元對各目標(biāo)基因的去除效果有明顯差異, 且存在去除量為負(fù)的現(xiàn)象。生物處理單元中微生物群落的變化可能是導(dǎo)致本研究中 ARGs 去除或富集效果各異的重要原因[14]。Xu 等[15]和 B?rjesson 等[16]認(rèn)為, 二沉池內(nèi) ARGs 附著在生物質(zhì)上, 并隨之脫離液相進(jìn)入污泥中, 使水相中的 ARGs 減少。剩余污泥的外運是 ARGs 進(jìn)入自然環(huán)境的潛在途徑[6,17], 因此對剩余污泥的合理處置是十分必要的。ClO2消毒僅對和微生物總量有一定的削減作用, 不能有效地控制其他目標(biāo)基因。經(jīng)過全部工藝后, 目標(biāo)基因的削減量在1.26~2.30logs 之間, 順序為:>bla>>>。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1目標(biāo)基因之間的相關(guān)性

表 2 列出目標(biāo)基因絕對豐度之間的相關(guān)性分析結(jié)果。與,,bla之間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(<0.001)。是 I 型整合子中編碼整合酶的基因, 整合子幾乎存在于各種可移動遺傳元件和染色體上, 與 ARGs 在環(huán)境中的傳播、擴(kuò)散聯(lián)系十分緊密[18–19]。I 型整合子可能是這幾類抗性基因傳播擴(kuò)散的重要機(jī)制。

2.3.2水質(zhì)因子與目標(biāo)基因的相關(guān)性

表 3 列出水質(zhì)因子與目標(biāo)基因之間的相關(guān)性分析結(jié)果。結(jié)果表明,和微生物總量分別與pH 顯著負(fù)相關(guān)(<0.05), 4 個目標(biāo)基因(,,bla和)分別與兩個水質(zhì)因子(COD 和 NH3-N)之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(<0.05), 總 ARGs 與NH3-N 顯著正相關(guān)(<0.05), 微生物總量與 TP 顯著正相關(guān)(<0.01)。N?lvak 等[20]、奚慧[21]和杜雪[22]的研究結(jié)果分別表明 ARGs 與 pH, NH3-N 及 COD 之間正相關(guān), 本文結(jié)果與之一致, 可能的原因為碳、氮和磷等營養(yǎng)元素促進(jìn)微生物的生長繁殖, 從而有助于 ARGs 的擴(kuò)散[23]。上述研究結(jié)果說明對污水處理廠基本水質(zhì)指標(biāo)(pH, COD 和 NH3-N 等)的監(jiān)測可能有助于預(yù)測 ARGs 的豐度水平, 可為揭示污水處理系統(tǒng)的 ARGs 污染風(fēng)險提供幫助。

表2 目標(biāo)基因之間的相關(guān)性分析

注: ***表示在0.001(雙側(cè))水平上顯著相關(guān), **表示在 0.01(雙側(cè))水平上顯著相關(guān), *表示在0.05 (雙側(cè))水平上顯著相關(guān), 下同。

表3 水質(zhì)因子與目標(biāo)基因之間的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本研究采集一座中小型生活污水處理廠中各工藝單元水樣, 進(jìn)行 4 種 ARGs 的定性和定量檢測分析, 揭示城鎮(zhèn)污水處理過程中 ARGs 的分布和變化規(guī)律, 得到如下結(jié)論。

1),,,bla與 I 型整合子普遍存在于城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中。進(jìn)水中的絕對和相對豐度最高, 出水中的絕對和相對豐度最高。總出水中目標(biāo)基因的絕對豐度分布在 3.40×103~3.05×106copies/mL 之間, 相對豐度分布在 6.76× 10?5~ 5.71×10?2之間。

2)污水處理降低 4 種 ARGs 和 I 型整合子的絕對豐度(去除量在 1.26~2.30logs 之間), 提高,和的相對豐度。

3)相關(guān)性分析表明,,和bla之間以及 I 型整合子與,,bla之間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(<0.0001); pH, COD 和 NH3-N 等水質(zhì)因子與 ARGs、I 型整合子和微生物量之間存在一定的相關(guān)性(<0.005)。

[1] Sharma V K, Johnson N, Cizmas L, et al. A review of the influence of treatment strategies on antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere, 2016, 150(70): 2–14

[2] Zhang X X, Zhang T, Fang H. Antibiotic resistance genes in water environment. Appl Microbiol Bio-technol, 2009, 82(3): 397–414

[3] 羅義, 周啟星. 抗生素抗性基因(ARGs) —— 一種新型環(huán)境污染物. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2008, 28(8): 13–19

[4] Wen Qinxue, Yang Lian, Duan Ruan, et al. Monito-ring and evaluation of antibiotic resistance genes in four municipal wastewater treatment plants in Harbin, Northeast China. Environmental Pollution, 2016, 212: 34–40

[5] Mcconnell M M, Truelstrup Hansen L, Jamieson R C, et al. Removal of antibiotic resistance genes in two tertiary level municipal wastewater treatment plants. Science of the Total Environment, 2018, 643: 292–300

[6] Guo Jianhua, Li Jie, Chen Hui, et al. Metagenomic analysis reveals wastewater treatment plants as hot-spots of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements. Water Research, 2017, 123(4): 68–78

[7] Zhang Qianqian, Ying Guangguo, Pan Changgui, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resis-tance. Environmental science & technology, 2015, 49 (11): 72–82

[8] 國家環(huán)保局水和廢水監(jiān)測分析方法編委會. 水和廢水監(jiān)測分析方法. 第四版. 北京: 中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002

[9] 張衍, 陳呂軍, 謝輝, 等. 兩座污水處理系統(tǒng)中細(xì)胞態(tài)和游離態(tài)抗生素抗性基因的豐度特征. 環(huán)境科學(xué), 2017, 38(9): 273–280

[10] Yoon Y, Chung H J, Wen Di D Y, et al. Inactivation efficiency of plasmid-encoded antibiotic resistance genes during water treatment with chlorine, UV, and UV/H2O2. Water Research, 2017, 123(7): 83–93

[11] 楊繼平. 天津海河流域抗生素抗性基因分布特征及與指示微生物的關(guān)系[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2017

[12] Lorenzo P, Adriana A, Jessica S, et al. Antibiotic resistance in urban and hospital wastewaters and their impact on a receiving freshwater ecosystem. Chemos-phere, 2018, 206: 70–82

[13] Mcconnell M M, Hansen L T, Neudorf K D, et al. Sources of antibiotic resistance genes in a rural river system. Journal of Environmental Quality, 2018, 47-(5): 997–1005

[14] Narciso-Da-Rocha C, Rocha J, Vaz-Moreira I, et al. Bacterial lineages putatively associated with the dis-semination of antibiotic resistance genes in a full-scale urban wastewater treatment plant. Environment International, 2018, 118(1): 79–88

[15] Xu Yanbin, Hou Maoyu, Li Yafei, et al. Distribu- tion of tetracycline resistance genes and AmpC-lactamase genes in representative non-urban sewage plants and correlations with treatment processes and heavy metals. Chemosphere, 2017, 170(2): 74–81

[16] B?rjesson S, Mattsson A, Lindgren P E, et al. Genes encoding tetracycline resistance in a full-scale muni-cipal wastewater treatment plant investigated during one year. Journal of Water and Health, 2010, 8(2): 247–256

[17] 張明美. 污水處理系統(tǒng)中抗生素抗性基因污染研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2013

[18] Ma Liping, Li A D, Yin Xiaole, et al. The prevalence of integrons as the carrier of antibiotic resistance genes in natural and man-made environments. Environ-mental science & technology, 2017, 51(10): 5721–5728

[19] 蘇志國, 張衍, 代天嬌, 等. 環(huán)境中抗生素抗性基因與Ⅰ型整合子的研究進(jìn)展. 微生物學(xué)通報, 2018, 45(10):153–169

[20] N?lvak H, Truu M, Oopkaup K, et al. Reduction of antibiotic resistome and integron-integrase genes in laboratory-scale photobioreactors treating municipal wastewater. Water Research, 2018, 142(3): 63–72

[21] 奚慧. 上海城市典型水體中抗生素性基因時空分布特征及其影響子研究[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2018

[22] 杜雪. 南昌市四種典型地表水體抗生素污染特征與生態(tài)風(fēng)險評估[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2015

[23] Yuan Qingbin, Guo Meiting, Yang jian. Monitoring and assessing the impact of wastewater treatment on release of both antibiotic-resistant bacteria and their typical genes in a Chinese municipal wastewater treatment plant. Environ Sci Process Impacts, 2014, 16(8): 1930–1937

Variations of 4 Antibiotic Resistance Genes in a Sewage Treatment Plant

BAO Yingyu1, XIE Hui2, CHEN Lüjun2, WEN Donghui1,?

1. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871; 2. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084; ? Corresponding author, E-mail: dhwen@pku.edu.cn

In order to understand the variations of antibiotic resistance genes (ARGs) in sewage treatment plants(STPs), the distribution and removal efficiencies of 4 subtypes of intracellular ARGs (,,andbla) and class I integron integrase gene () in amiddle-scale STP in Hebei Province were detected by PCR and real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR). 4 ARGs andwere found in all water samples and 1.26–2.30 orders of magnitude of ARGs were removed by the STP. Correlation analysis showed thatand water quality factors including pH, COD, and NH3-N might affect the distribution and diffusion of,, and bla. The final effluent of a STP may promote the spread of ARGs in surface water system.

antibiotic resistance genes (ARGs); sewage treatment plants (STPs); A2/O process; real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR)

10.13209/j.0479-8023.2020.046

國家自然科學(xué)基金(51678003, 51678334)資助

2019–06–13;

2019–10–31