向殿軍，滿(mǎn)麗莉，王曉東，張巍巍，劉 鵬，李志剛

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028042)

植物蔗糖非發(fā)酵-1相關(guān)蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,SNRK)家族屬于CDPK-SNRK超家族，與酵母的蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶1(SNF1)和哺乳動(dòng)物的AMP激活的蛋白激酶(AMPK)同源[1]。在酵母和哺乳動(dòng)物中，SNF1和AMPKs在碳水化合物代謝中扮演重要角色；而在植物中，SnRKs在連接脅迫信號(hào)和新陳代謝通路方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-4]。根據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域的相似性，植物SnRKs又可分為SnRK1、SnRK2和SnRK3三個(gè)亞家族[4]。

SnRK2蛋白激酶是主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在調(diào)節(jié)真核生物適應(yīng)環(huán)境方面起核心作用。水稻中的SAPK4和小麥中的TaSRK2C1均屬于SnRK2蛋白激酶家族基因。在鹽脅迫下，SAPK4基因的過(guò)表達(dá)減少了水稻中Na+和Cl-的積累，并使水稻光合作用和生長(zhǎng)狀況得到明顯改善[5]。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)TaSRK2C1基因煙草中具有較高水平的游離脯氨酸和可溶性碳水化合物，說(shuō)明TaSRK2C1的異源表達(dá)提高了煙草對(duì)高鹽、脫水和低溫脅迫的耐受性[6]。TaSnRK2.8基因的異源過(guò)表達(dá)可改善擬南芥的主根長(zhǎng)、相對(duì)含水量、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、滲透勢(shì)和葉綠素含量等生理特性，從而使擬南芥對(duì)干旱、鹽和冷脅迫的耐受性得到增強(qiáng)[7]。SnRK2蛋白激酶可通過(guò)控制鎘離子引發(fā)的活性氧積累，調(diào)節(jié)植物對(duì)重金屬脅迫的耐受性[8]。在干旱脅迫下，脫落酸(ABA)使植物氣孔關(guān)閉，從而減少水分損失，而擬南芥snrk2e(snrk2.6/ost1)突變體則破壞了ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉機(jī)制，抑制氣孔開(kāi)放，表明SnRK2E參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)[9]。

SnRK2蛋白激酶主要通過(guò)ABA依賴(lài)或非ABA依賴(lài)途徑在應(yīng)答逆境脅迫的防御機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[10]。其中，ABA依賴(lài)型的SnRK2蛋白激酶(如擬南芥SnRK2D、SnRK2I和SnRK2E)在ABA信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用[11]，其調(diào)控通路模型主要由可溶性ABA受體(PYR/PYL/RCAR)、蛋白磷酸酶2C(PP2C)和SnRK2絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族組成[12-14]。在沒(méi)有ABA的情況下，PP2Cs發(fā)生去磷酸化作用，鈍化了SnRK2s活性，進(jìn)而抑制SnRK2s磷酸化調(diào)控的反應(yīng)通路。

目前，一些植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)已被鑒定為SnRK2蛋白激酶的底物[15-17]。此外，在一些異源表達(dá)SnRK2基因的植物中，也發(fā)現(xiàn)一些SnRK2蛋白激酶作用的靶標(biāo)基因[6-7]。如小麥TaSRK2C1蛋白激酶能顯著上調(diào)煙草DREB2、DREB1A和DREB2三個(gè)中樞調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平[6]，而小麥TaSnRK2.8蛋白激酶則能調(diào)控?cái)M南芥中CBF3、CBF2、CBF1、RD29B、RD20A、ABI5、ABI4、ABI3、ABA2和ABA1基因的mRNA水平[7]。

目前，SnRK2基因家族在小麥[6-7]、波蘭小麥[18]和二穗短柄草[19]等一些燕麥(AvenasativaL.)近源種中已得到研究，但有關(guān)SnRK2基因在燕麥中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以皮燕麥品種美達(dá)為材料，借助前人獲得的干旱脅迫下燕麥RNA序列信息，克隆SnRK2蛋白激酶家族基因AsSnRK2.7，利用生物信息學(xué)手段和煙草表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)分別對(duì)AsSnRK2.7蛋白的分子特征和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，同時(shí)借助qRT-PCR技術(shù)對(duì)AsSnRK2.7基因的非生物脅迫反應(yīng)和組織表達(dá)特異性進(jìn)行研究，以期為揭示AsSnRK2.7基因應(yīng)答逆境脅迫的分子機(jī)制及其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為美國(guó)皮燕麥品種美達(dá)(Monida)，購(gòu)于北京正道生態(tài)科技有限公司，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁并保存。

1.2 材料處理

將發(fā)育良好、飽滿(mǎn)的燕麥種子用0.1% HgCl2溶液表面消毒30 min，用無(wú)菌水洗滌數(shù)次后，將種子放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿上，置于發(fā)芽箱(23±1 °C，光照12 h，黑暗12 h)中，每日添加10 mL無(wú)菌水，至種子發(fā)芽。將發(fā)芽整齊一致的種子分成兩份，一份轉(zhuǎn)移至盛有1/2 Hoagland培養(yǎng)液的水培盤(pán)(32.5 cm×26 cm×5.5 cm)中，一份播種到土壤中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1，20 ℃暗培養(yǎng)9 h，25 ℃光照15 h。待水培燕麥幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，分別進(jìn)行ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫處理。ABA脅迫處理：用ABA溶液(100 μmol·L-1)噴灑燕麥；干旱脅迫處理：水培液中添加PEG6000(25 mmol·L-1)；高鹽脅迫處理：水培液中添加NaCl(300 mmol·L-1)；低溫脅迫處理：將水培燕麥幼苗置于低溫(4 ℃)光照培養(yǎng)箱中。水培燕麥在脅迫處理0、1、2、4、8、16、24、48和72 h后，剪取葉片，液氮迅速冷凍后-70 ℃保存，用于脅迫表達(dá)模式分析，其中脅迫處理 24 h的葉片用于基因克?。淮柙匝帑溦ＩL(zhǎng)至苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期時(shí)，分別收集葉、根、莖和穗組織(抽穗期、灌漿期和成熟期)，液氮迅速冷凍后-70 ℃保存，用于組織表達(dá)模式分析。

1.3 燕麥 AsSnRK2.7基因的克隆

表1 本研究所用的引物

1.4 燕麥 AsSnRK2.7基因生物信息學(xué)分析

運(yùn)用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)基因的開(kāi)放閱讀框。采用Translate(https://web.expasy.org/translate/)推導(dǎo)目的基因編碼的氨基酸序列。使用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)編碼蛋白進(jìn)行同源搜索。利用NCBI中的CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。采用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，基于輸出的序列比對(duì)結(jié)果，利用GeneDoc和MEGA 5.1軟件分別進(jìn)行多重序列比對(duì)圖和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的繪制。運(yùn)用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)工具預(yù)測(cè)蛋白的功能區(qū)和激活位點(diǎn)。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)編碼蛋白的疏水性/親水性。用DictyOGlyc 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/dictyoglyc/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的O-糖基化修飾位點(diǎn)；利用Motif Scan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)預(yù)測(cè)編碼蛋白的生物活性位點(diǎn)；利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)。利用PONDR(http://www.pondr.com/)分析編碼蛋白的無(wú)序化；利用TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/)預(yù)測(cè)氨基酸序列導(dǎo)肽；利用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預(yù)測(cè)編碼蛋白的互作蛋白。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用PDBsum(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)檢測(cè)模型質(zhì)量。

1.5 燕麥 AsSnRK2.7基因的亞細(xì)胞定位

1.6 燕麥 AsSnRK2.7基因的表達(dá)特性分析

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥 AsSnRK2.7全長(zhǎng)cDNA的克隆結(jié)果

以干旱脅迫24 h的燕麥葉片cDNA第一鏈為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約250 bp和1 000 bp的2條cDNA片段(圖1)，其中，1 000 bp的條帶與預(yù)期大小一致?；厥臻L(zhǎng)度約 1 000 bp的片段，進(jìn)行T-A克隆后并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該片段長(zhǎng)度為1 074 bp。ORF預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該基因包含一個(gè)1 074 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼357個(gè)氨基酸。BLAST結(jié)果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumelongatum，QDA34118.1)、粗山羊草(Aegilopstauschii，XP_020174011.1)、波蘭小麥(Triticumpolonicum，ALL27274.1)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon，NP_001304805.1)、水稻(Oryzasativa，XP_004975639.1)、谷子(Setariaitalica，XP_004975639.1)、高粱(Sorghumbicolor，XP_021318906.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_195711.1)SnRK2蛋白激酶氨基酸序列的一致性分別為99.75%、96.92%、96.64%、96.36%、91.64%、90.50%、89.97%和 62.01%。利用NCBI CD-Search在線工具對(duì)該基因編碼的蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個(gè)STKc_SnRK2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PKc_like superfamily結(jié)構(gòu)域，屬于SnRK2蛋白激酶家族成員(圖2)。將獲得的cDNA片段命名為AsSnRK2.7，提交至Genbank，獲得登錄號(hào)為MN729577。

1：cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物；M：Marker DL2000。

圖2 AsSnRK2.7蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 燕麥AsSnRK2.7蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對(duì)結(jié)果表明，AsSnRK2.7蛋白與玉米(Zeamays，ACG50009.1)、粳稻(OryzasativaJaponica，BAD17998.1)、波蘭小麥(Triticumpolonicum，ALL27272.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_567945.1)和二穗短柄草(BrachySnRK2家族成員在C端呈現(xiàn)多變特異性，而在N端表現(xiàn)出高度的保守性(圖3)。

Ⅰ：蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)；Ⅱ：N-肉豆蔻?；饔梦稽c(diǎn)；Ⅲ：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)；Ⅳ：激活環(huán)；Ⅴ：跨膜螺旋位點(diǎn)；Ⅵ：響應(yīng)滲透脅迫所需的結(jié)構(gòu)域Ⅰ；Ⅶ：響應(yīng)ABA所需的結(jié)構(gòu)域Ⅱ。

進(jìn)化樹(shù)分析表明，來(lái)自10個(gè)物種的22個(gè)SnRK2蛋白被分成3個(gè)類(lèi)群(圖4)。其中，AsSnRK2.7蛋白與普通小麥(Triticumaestivum，ACU65228.1)、波蘭小麥(Triticumpolonicum，AHC00229.1)、玉米(Zeamays，ACG50009.1)、水稻(Oryzasativa，BAD18002.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_176290.1)、煙草(Nicotianatabacum，AAL89456.1)和馬鈴薯(Solanumtuberosum，AFR68941.1)的7個(gè)SnRK2成員親緣關(guān)系最近，被聚為Group Ⅰ(SnRK2b)。

圖4 不同物種SnRK2蛋白的聚類(lèi)分析

2.3 AsSnRK2.7蛋白功能區(qū)與生物活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

O-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AsSnRK2.7蛋白中第133和307位的氨基酸殘基可能成為O-糖基化修飾的位點(diǎn)。NetPhos預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白中有12個(gè)絲氨酸、9個(gè)蘇氨酸和7個(gè)絡(luò)氨酸殘基可能成為磷酸化修飾的位點(diǎn)。利用Motif Scan在線工具預(yù)測(cè)AsSnRK2.7生物活性位點(diǎn)，結(jié)果表明，該蛋白包含1個(gè)酰胺化位點(diǎn)(324～327 aa)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴(lài)性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(247～250 aa)、5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(96～99 aa、129～132 aa、172～175 aa、250～253 aa和290～293 aa)、2個(gè)N-肉豆蔻?；饔梦稽c(diǎn)(110～115 aa和239～244 aa)、3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(54～56 aa、172～174 aa和250～252 aa)、2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(94～102 aa和140～146 aa)、1個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)(10～33 aa)、1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)(119～131 aa)、富含谷氨酸的區(qū)域(318～347 aa)、1個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(4～60 aa)和1個(gè)酪氨酸蛋白激酶位點(diǎn)(4～85 aa)。

2.4 燕麥AsSnRK2.7蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)和疏水性/親水性分析

基于ProtParam工具對(duì)AsSnRK2.7蛋白理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，該蛋白含有20種氨基酸，帶正電氨基酸(Arg+Lys)和負(fù)電氨基酸(Asp+Glu)比例分別為13.16%和15.69%，含量較低的2種氨基酸分別為色氨酸(0.8%)和半胱氨酸(2.2%)，含量較高的4種氨基酸分別為谷氨酸(10.4%)、亮氨酸(7.0%)、賴(lài)氨酸(7.0%)和丙氨酸(6.4%)；理論等電點(diǎn)為5.63，分子量為 40 914.63。該蛋白總平均疏水性(GRAVY)、脂肪系數(shù)和不穩(wěn)定性系數(shù)分別為-0.540、75.94和43.08，是一種親水且不穩(wěn)定蛋白(總平均疏水性負(fù)值是親水蛋白，正值為疏水蛋白；穩(wěn)定蛋白系數(shù)小于40，不穩(wěn)定蛋白系數(shù)大于40)。

利用TMPred在線分析軟件對(duì)燕麥AsSnRK2.7蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，該蛋白僅存在一個(gè)分值大于500的跨膜區(qū)域(180～200 aa)，該跨膜區(qū)域既有從內(nèi)到外的跨膜能力(分值991)，又有從外到內(nèi)的跨膜能力(分值734)，推斷AsSnRK2.7為跨膜蛋白。利用ProtScale在線工具對(duì)燕麥AsSnRK2.7蛋白進(jìn)行疏水性/親水性分析，結(jié)果顯示，該蛋白包括明顯的疏水區(qū)(分值大于0.5)和親水區(qū)(分值小于-0.5)，且疏水區(qū)域少于親水區(qū)域。此外，組成AsSnRK2.7蛋白的357個(gè)氨基酸中，第339和340位氨基酸親水性最強(qiáng)，分值為-3.300；第191和192位氨基酸疏水性最強(qiáng)，分值為2.189。這些結(jié)果表明，燕麥AsSnRK2.7可能是一種親水蛋白，與ProtParam在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.5 AsSnRK2.7蛋白的固有無(wú)序化分析以及導(dǎo)肽和互作蛋白的預(yù)測(cè)

利用PONDR在線程序?qū)sSnRK2.7蛋白進(jìn)行折疊無(wú)序化分析，發(fā)現(xiàn)AsSnRK2.7是一個(gè)部分無(wú)序蛋白。AsSnRK2.7蛋白包含6個(gè)無(wú)序化區(qū)域，分別位于3～4 aa、23～36 aa、38～47 aa、159～172 aa、291～304 aa和309～356 aa，最長(zhǎng)的無(wú)序區(qū)域包含48個(gè)氨基酸殘基，無(wú)序化氨基酸總數(shù)為103個(gè)，無(wú)序化程度為28.85%。

利用TargetP 1.1在線工具對(duì)AsSnRk2.7蛋白進(jìn)行導(dǎo)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，燕麥AsSnRK2.7蛋白的分泌途徑信號(hào)肽、線粒體目標(biāo)肽、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和其他位置導(dǎo)肽的預(yù)測(cè)分值分別為0.026、0.168、0.036和0.891，預(yù)測(cè)可靠性為2級(jí)，不存在導(dǎo)肽酶切位點(diǎn)，不具有導(dǎo)肽性。

利用STRING在線程序預(yù)測(cè)顯示，在小麥中發(fā)現(xiàn)10個(gè)與AsSnRK2.7同源蛋白(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的互作蛋白(圖5)。其中，包含6個(gè)堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子、3個(gè)胱硫醚-β-合成酶和1個(gè)環(huán)核苷酸-單磷酸依賴(lài)蛋白激酶。

圖5 小麥中AsSnRK2.7同源蛋白的互作蛋白

2.6 AsSnRK2.7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 分析

AsSnRK2.7蛋白是一種混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，分別占38.94%和40.06%，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈占比較少，分別為5.60%和15.41%。

由圖6A可以看出，AsSnRK2.7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋，與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。利用PDBsum，對(duì)AsSnRK2.7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果可靠性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖6B)可以看出，AsSnRK2.7模型氨基酸在最佳允許區(qū)(A、B和L區(qū)域)、次允許區(qū)(a、b、l和p區(qū)域)、一般允許區(qū)(-a、-b、-l和-p區(qū)域)和不允許區(qū)的比列分別為64.1%、29.8%、4.8%和 1.3%。在最佳允許區(qū)和次允許區(qū)的氨基酸的比例為93.9%，說(shuō)明所構(gòu)建的AsSnRK20.7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型符合立體化學(xué)的規(guī)則。

A：AsSnRK2.7蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；B：AsSnRK2.7蛋白模型的拉氏構(gòu)象。

2.7 AsSnRK2.7蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析

從圖7可以看出，在pCAMBIA2300-CaMV35S-GFP轉(zhuǎn)化的煙草表皮細(xì)胞中，綠色熒光信號(hào)分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等區(qū)域。而35S-AsSnRK2.7-GFP轉(zhuǎn)化的煙草表皮細(xì)胞中，綠色熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞核。將GFP、CHI、DAPI以及DIC通道融合后，35S-AsSnRK2.7-GFP融合蛋白所表達(dá)的綠色熒光與藍(lán)色的DAPI相重合，表明AsSnRK2.7蛋白在煙草表皮細(xì)胞中定位于細(xì)胞核。

GFP：綠色熒光；CHL:葉綠體自發(fā)熒光；DAPI：細(xì)胞核特異標(biāo)記；DIC：微分干涉對(duì)比；Merge：疊加場(chǎng)。35S-GFP為空載體，35S-AsSnRK2.7-GFP為包含AsSnRK2.7的融合蛋白載體。標(biāo)尺=25 μm。

2.8 AsSnRK2.7基因的qPCR表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果(表2)顯示，AsSnRK2.7基因在燕麥被檢測(cè)組織中為組成型表達(dá)。在根組織中，AsSnRK2.7基因在苗期表達(dá)量最高，灌漿期次之，成熟期最低。在葉片組織中，AsSnRK2.7基因在分蘗期的表達(dá)量最高，分別是苗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的5.57、2.61、2.33和20.19倍。在莖和穗組織中，AsSnRK2.7基因表達(dá)量分別在抽穗期和灌漿期最高，在成熟期最低。

表2 不同組織中 AsSnRK2.7基因的相對(duì)表達(dá)量

從表3可以看出，ABA不能激活A(yù)sSnRK2.7基因的表達(dá)，但其表達(dá)積極響應(yīng)PEG、鹽和低溫(4 ℃)的脅迫。在PEG脅迫下，AsSnRK2.7基因出現(xiàn)了雙峰表達(dá)模式，峰值分別出現(xiàn)在2 h和16 h，且在2 h表達(dá)量最高。在鹽脅迫下，AsSnRK2.7基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在4 h達(dá)到最高。在低溫脅迫下，AsSnRK2.7基因的表達(dá)量在0～4 h持續(xù)上調(diào)，在16 h達(dá)到最高。

表3 不同脅迫下 AsSnRK2.7基因的轉(zhuǎn)錄水平

3 討 論

SnRK2蛋白激酶基因?qū)儆诙嗷蚣易?，在水稻[22]、玉米[23]和擬南芥基因組中分別存在10、11和10個(gè)AsSnRK2基因[24]。本研究依據(jù)干旱脅迫下燕麥轉(zhuǎn)錄組中的序列信息，利用RT-PCR技術(shù)，首次從燕麥中分離出一個(gè)SnRK2蛋白激酶基因AsSnRK2.7。AsSnRK2.7基因cDNA長(zhǎng)度為1 074 bp，與波蘭小麥[18]和二穗短柄草[19]SnRK2.7基因的開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)度完全一致。生物信息學(xué)分析表明，AsSnRK2.7蛋白含有SnRK2蛋白激酶家族特有的功能域，包括蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)、N-肉豆蔻?；饔梦稽c(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、激活環(huán)、跨膜螺旋位點(diǎn)和響應(yīng)滲透脅迫所需的結(jié)構(gòu)域Ⅰ等重要功能區(qū)，表明不同植物中SnRK2蛋白激酶成員結(jié)構(gòu)十分保守，這與前人在小麥[6-7]、波蘭小麥[18]和二穗短柄草[19]中的研究結(jié)果一致。

N-肉豆蔻?；饔梦稽c(diǎn)和跨膜區(qū)是蛋白質(zhì)在植物應(yīng)答環(huán)境脅迫反應(yīng)中調(diào)節(jié)膜靶向和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵區(qū)域[25-26]。TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和TaSnRK2.8蛋白均定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且過(guò)表達(dá)這3個(gè)基因均能增強(qiáng)擬南芥對(duì)干旱、鹽和冷脅迫的耐受性[7，27-28]。TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和 TaSnRK2.8蛋白中均存在一個(gè)潛在的N-肉豆蔻酰化作用位點(diǎn)和一個(gè)潛在的跨膜區(qū)，表明SnRk2s可能與細(xì)胞膜或核受體結(jié)合而相互作用[7,27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，AsSnRK2.7蛋白中也存在一個(gè)潛在的N-肉豆蔻?；饔梦稽c(diǎn)和一個(gè)潛在的跨膜區(qū)，但僅定位在細(xì)胞核中。

盡管在5個(gè)發(fā)育階段的根、葉、莖和穗(抽穗期、灌漿期和成熟期)組織中均能檢測(cè)到AsSnRK2.7基因的表達(dá)，但在不同發(fā)育階段的不同組織中，AsSnRK2.7基因的相對(duì)表達(dá)量不同，這與小麥中SnRK2成員研究的報(bào)道一致。如小麥TaSnRK2.7基因的表達(dá)量在苗期的根組織中較高，而在苗期的葉片、孕穗期的穗和抽穗期的劍葉組織中較低[28]。TaSnRK2.4基因在孕穗期的穗中表達(dá)量較高，在苗期的根和抽穗期的劍葉中次之，而在苗期的葉片中最低[27]。這些結(jié)果表明，SnRK2基因存在著明顯的空間和時(shí)間上的表達(dá)差異，在正常生長(zhǎng)條件下調(diào)節(jié)不同生理代謝過(guò)程。

根據(jù)C末端富集的酸性氨基酸的類(lèi)型，SnRK2蛋白激酶可分為兩個(gè)亞組：富含天冬氨酸的SnRK2a(為ABA依賴(lài)型SnRK2s)和富含谷氨酸的SnRK2b(為非ABA依賴(lài)型SnRK2s)[2,29]。根據(jù)序列相似性、功能域結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能，植物SnRK2亞家族可分為三個(gè)亞組：Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ，其中，Group Ⅱ和Group Ⅲ兩個(gè)亞組屬于SnRK2a，而Group Ⅰ屬于SnRK2b[1]。Group III中的SnRK2成員對(duì)ABA具有強(qiáng)烈的響應(yīng)，Group II成員不受或微弱受ABA激活，Group I成員不被ABA脅迫誘導(dǎo)，而Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ成員均受滲透脅迫的激活[22,24]。本研究發(fā)現(xiàn)，AsSnRK2.7屬于Group I(SnRK2b)中成員，對(duì)外源ABA的誘導(dǎo)不敏感，說(shuō)明AsSnRK2.7蛋白激酶可能是一個(gè)非ABA依賴(lài)型SnRK2成員，這與Group I成員不被ABA脅迫誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致。然而，在玉米中ZmSnRK2.4、ZmSnRK2.5、ZmSnRK2.7和小麥中的TaSnRK2.4也屬于Group I成員，但卻能被ABA脅迫誘導(dǎo)[23,27]。此外，在本研究中，AsSnRK2.7基因能夠積極應(yīng)答低溫、鹽和PEG脅迫，表明AsSnRK2.7基因同其他SnRK2成員一樣在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫耐受性中起關(guān)鍵作用。然而，前人研究表明，ZmSnRK2.7基因不含低溫應(yīng)答元件(LTRE)，但仍可被冷脅迫所誘導(dǎo)[23]。所以，非ABA依賴(lài)型SnRK2基因結(jié)構(gòu)與其受逆境脅迫應(yīng)答的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

已有研究表明，SnRK2蛋白激酶N端激活環(huán)上絲氨酸殘基的可逆磷酸化可調(diào)控SnRK2活性[31-33]。目前對(duì)于非ABA依賴(lài)型SnRK2的可逆磷酸化報(bào)道較少，但有關(guān)ABA依賴(lài)型SnRK2的可逆磷酸化的研究較多。SnRK2蛋白激酶在響應(yīng)滲透脅迫與ABA過(guò)程中自身磷酸化機(jī)制不同，滲透脅迫誘導(dǎo)的磷酸化水平普遍高于ABA誘導(dǎo)的磷酸化水平，另外在滲透脅迫下不同的SnRK2蛋白激酶的磷酸化水平也不同[31]。煙草中的NtOSAK和擬南芥中的SnRK2.10均屬于GroupI，為響應(yīng)滲透脅迫的非ABA依賴(lài)型SnRK2成員，這2個(gè)蛋白激酶激活環(huán)中均存在2個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)，且這2個(gè)位點(diǎn)的可逆磷酸化均可調(diào)節(jié)激酶活性，并存在順序性，其中一個(gè)絲氨酸的磷酸化是另一個(gè)絲氨酸磷酸化所必需的[29-30]。然而，Group III中擬南芥ABA依賴(lài)型激酶則是通過(guò)2個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)磷酸化來(lái)調(diào)控激酶活性[30]。本研究基于NetPhos在線分析，發(fā)現(xiàn)AsSnRK2.7蛋白質(zhì)的激活環(huán)(ICDFGYSKSSLLHSKPKSTVGTPAYIAPE)上存在2個(gè)可逆的蛋白質(zhì)磷酸化殘基(帶下劃線的氨基酸殘基)，分別位于Ser-154和Ser-158，但其激活環(huán)上的2個(gè)磷酸化位點(diǎn)磷酸化是否對(duì)AsSnRK2.7蛋白激酶活性調(diào)控具有協(xié)同作用，還需進(jìn)一步的研究。

SnRK2蛋白激酶可通過(guò)磷酸化作用來(lái)影響下游底物的活性。SnRK2蛋白激酶如SnRK2.2/SRK2D、SnRK2.6/SRK2E和SnRK2.3/SRK2I可以在體外磷酸化擬南芥AREB1蛋白[11]。目前，植物中僅有少數(shù)蛋白被被證實(shí)為SnRK2蛋白激酶的底物，包括轉(zhuǎn)錄bZIP型轉(zhuǎn)錄因子ABF/AREB和AP2/ERF-型轉(zhuǎn)錄因子DREB[15,17]。此外，Wang等[16]通過(guò)定量磷酸化蛋白組學(xué)鑒定了一些SnRK2s底物，這些SnRK2s底物包括參與開(kāi)花時(shí)間調(diào)控、RNA和DNA結(jié)合、miRNA和表觀遺傳調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ABF2、AREB3、TAF5、EEL和FBH3等)、葉綠體功能及許多其他細(xì)胞過(guò)程的蛋白質(zhì)。本研究使用STRING在線程序在小麥中找到與AsSnRK2.7同源蛋白可能存在互作關(guān)系的蛋白，包括bZIP轉(zhuǎn)錄因子、胱硫醚-β-合成酶和環(huán)核苷酸-單磷酸依賴(lài)蛋白激酶。這些蛋白對(duì)植物抗逆性有重要影響，因此，這些蛋白的發(fā)現(xiàn)將為利用燕麥AsSnRK2.7基因來(lái)改善植物的抗逆性提供理論基礎(chǔ)。