剛琳霞，任丹鳳，程林林，楊細燕，郭小平

（華中農(nóng)業(yè)大學植物與科學技術學院/ 作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢430070）

棉花是主要經(jīng)濟作物之一，其最大的副產(chǎn)品棉籽中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，但因內(nèi)含棉酚，利用之前必須進行脫毒處理，棉酚含量低于國家食用安全標準（0.45 μg·mg－1）才能使用。同時，棉酚等倍半萜烯化合物在棉花遭遇病蟲害時起一定的防御作用。 因此，種子低酚而植株棉酚含量不受影響的棉花品種選育工作一直受到重視。

植物在生長發(fā)育過程中積累大量次生代謝物，廣泛參與植物與生物因子及非生物因子的互作過程，使植物能夠適應多變的環(huán)境。 萜烯作為最大類別的次級代謝產(chǎn)物，在植物對抗昆蟲、病原菌等外來侵害時發(fā)揮著重要作用。棉酚是棉屬植物特有的1 種黃色二聚倍半萜烯化合物， 在根部合成后運輸、儲存在植株各組織表皮的色素腺體中[1]。 棉株各部位的棉酚含量不同，其中成熟種子及果皮中棉酚含量達2%（質(zhì)量分數(shù)， 下同）， 下胚軸中只有0.05%；在發(fā)育15～20 d 的種子中棉酚開始合成積累，到30 d 左右棉酚含量急劇增加[2]。 棉酚在棉株中以2 種化學形式存在， 右旋 （＋）- 棉酚和左旋（－）- 棉酚，這2 種形式的棉酚在不同的棉種以及相同棉種的不同組織中含量均有較大差異。陸地棉中右旋（＋）-棉酚的含量遠遠高于左旋 （－）- 棉酚。 陸地棉種子中棉酚主要以左旋（－）-棉酚形式存在，花、根中棉酚主要以右旋（＋）- 棉酚形式存在[3]。 在植物體內(nèi)棉酚存在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2 種形態(tài)，游離態(tài)形式保持棉酚原有的生物活性；而結(jié)合態(tài)棉酚是通過共價鍵連接氨基酸殘基后形成的，無生物活性。 棉酚化學結(jié)構(gòu)中存在的2 個官能團：活性羥基和活性醛基，決定了棉酚的毒性[4]，很多研究證明棉酚對家禽具有毒害作用。棉酚能夠破壞人和單胃動物的胃粘膜，導致其消化功能損害，反芻動物對棉酚的毒性雖然不如單胃動物敏感，但是攝入過量棉酚也會導致中毒現(xiàn)象，動物的中毒癥狀大多為呼吸困難、抽搐、厭食，嚴重可導致死亡[5]。棉酚含量受外部環(huán)境因素的影響，比如與降雨量呈正相關關系，與溫度呈負相關關系[6]。

倍半萜烯化合物是在細胞質(zhì)中合成的，棉酚作為倍半萜烯的1 種衍生物，它在棉花細胞內(nèi)是從甲羥戊酸途徑開始合成的[7]。 首先，3- 羥基-3- 甲基戊二酰輔酶A 在3- 羥基-3- 甲基戊二酰輔酶A還原酶的作用下還原成甲羥戊酸，甲羥戊酸經(jīng)過一系列反應生成異戊烯基二磷酸及其異構(gòu)體二甲丙烯基焦磷酸，異戊烯基二磷酸和二甲丙烯基焦磷酸在法尼基焦磷酸合成酶的催化下縮合形成法尼基二磷酸。 法尼基二磷酸在杜松烯合酶（Cadinene synthase 1,CAD1）的作用下環(huán)化生成（＋）-δ- 杜松烯， 這一步是棉酚合成途徑的限速步驟；（＋）-δ-杜松烯在杜松烯-7- 羥化酶的作用下羥基化形成7- 羥基-（＋）-δ- 杜松烯，之后7- 羥基-（＋）-δ-杜松烯經(jīng)過一系列反應生成半棉酚、 脫氧半棉酚、棉酚等物質(zhì)[8]。

CAD1 是1 種富含天冬氨酸的倍半萜烯環(huán)化酶[9]，是棉酚合成途徑的限速酶。CAD1 基因分為4個亞類：CAD1-A、CAD1-B、CAD1-C、CAD1-D，四者的氨基酸序列相似性高達95%以上[10]，CAD1-B和CAD1-D亞家族中大部分基因為假基因， 所以杜松烯合酶基因的研究大多在CAD1-A和CAD1-C上。CAD1-A和CAD1-C表達模式不同，CAD1-A主要在根部和胚珠中表達，CAD1-C在根、莖、葉、花蕾、胚珠等部位均有表達[10]。 在CAD1-A基因和CAD1-C基因的啟動子區(qū)域存在1 個能與真菌激發(fā)子結(jié)合的W-box （TTGACC）調(diào)控元件[11]，Xu 等從亞洲棉中克隆到1 個GaWRKY1 基因，GaWRKY1 可以與CAD1-A啟動子中的W-box 相結(jié)合，進而調(diào)控CAD1-A基因的表達[12]。

隨著生物技術的迅速發(fā)展，研究者們用不同的方法對CAD1 進行了不同程度的干涉。 如Martin等利用反義RNA 技術將CAD1-C1 的反義cDNA轉(zhuǎn)到棉花中，獲得的轉(zhuǎn)基因后代種子棉酚含量下降了70%[13]；Townsend 等通過反義抑制CAD1-C4 基因的表達并沒有達到降低種子中棉酚含量的目的[14]；Sunilkumar 等通過RNAi（RNA interference，RNA 干擾）技術并結(jié)合種子特異性啟動子，沉默了當時已知的大部分CAD1-C基因， 獲得了可以穩(wěn)定遺傳的種子低酚的棉花株系[8]。 本研究利用RNAi 技術結(jié)合種子特異性啟動子特異性降低Gh-CAD1-A在種子中的表達量，從而獲得種子低酚而葉片等其它組織棉酚含量不受影響的低酚棉材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的棉花材料為高效體胚發(fā)生陸地棉材料Jin668；引物合成由北京擎科生物技術有限公司完成；植物基因組DNA 提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、快速小提質(zhì)粒試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；TA 連接反應試劑及常規(guī)PCR 試劑購自北京全式金生物公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑購自普洛麥格 （北京）生物技術有限公司；qRT-PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction， 實時定量聚合酶鏈式反應）試劑購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；提取棉酚所用色譜級試劑購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；棉酚標準樣品購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 菌株和載體

大腸桿菌菌株Top10 和DB3.1、根瘤農(nóng)桿菌菌株GV3101、雙元載體pHellsgate4 均由本實驗室提供，pGEM T-easy 載體購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1PαGlob-GhCAD1-A-RNAi 載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化。 載體構(gòu)建參照文獻[15],首先在Cottongen 上查找陸地棉 （＋）-δ- 杜松烯合酶基因GhCAD1-A（Ghir_D13G015610）的序列，利用Primer premier 5根據(jù)GhCAD1-A的編碼序列目標區(qū)段， 設計引物GhCAD1-F 和GhCAD1-R （表1）， 以Jin668 的cDNA 為模板擴增GhCAD1-A目的片段， 然后通過Gateway 技術將擴增的PCR 產(chǎn)物通過同源重組插入到雙元載體pHellsgate4 中， 得到35s-pHellsgate4-GhCAD1-A 載體。在NCBI 上查找α-球蛋白啟動子PαGlob（GenBank: HQ689654.1） 的序列，用Primer premier 5 設計α-球蛋白啟動子的引物Gh-PαGlob-F 和GhPαGlob-R （表1）， 并引入限制性內(nèi)切酶SacI 和XhoI 酶切位點，以Jin668 胚珠DNA 為模板克隆α-球蛋白啟動子PαGlob。 PαGlob片段和35s-pHellsgate4-GhCAD1-A 載體使用SacI 和XhoI 雙酶切，電泳分離目的片段，進行切膠回收，并用T4 連接酶連接構(gòu)建種子特異啟動子驅(qū)動的干涉載體PαGlob-GhCAD1-A-RNAi， 利用PCR 技術、XhoI 及XbaI 分別單酶切驗證，并通過測序驗證。最后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 菌株中，并轉(zhuǎn)化至棉花Jin668。

1.3.2轉(zhuǎn)基因植株的陽性檢測及Southern 雜交。獲得T0轉(zhuǎn)基因植株后， 利用CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因植株的葉片DNA， 設計引物AGP-F和CAD1-R（表1）并進行PCR 陽性檢測。 對PCR 陽性檢測結(jié)果為陽性的T1轉(zhuǎn)基因植株進行Southern 雜交， 確定其拷貝數(shù)。

1.3.3轉(zhuǎn)基因植株目的基因的表達量測定。 取T3轉(zhuǎn)基因植株開花后35 d 的棉桃，提取總RNA，用普洛麥格（北京）生物技術有限公司的反轉(zhuǎn)試劑盒進行RNA 反轉(zhuǎn)錄，具體步驟參考試劑盒說明書。

通過qRT-PCR 檢測目的基因GhCAD1-A表達量， 并同時檢測其上下游基因GhFPS、Gh-CYP706B1 的表達量，以GhUB7 為內(nèi)參基因，所用引物見表1。 qRT-PCR 反應及分析參照文獻[16]。

表1 本研究中使用的引物

1.3.4棉花種子腺體的觀察。參照文獻[17]，將成熟種子去殼后放置水中，室溫下種子吸脹后去除種皮，利用體視顯微鏡對處理后的種子色素腺體進行觀察。

1.3.5轉(zhuǎn)基因植株棉酚含量的測定。取T3轉(zhuǎn)基因植株及對照材料花期的倒三葉、幼蕾、開花當天花瓣、開花1 d 后萼片和成熟種子提取棉酚，棉酚提取方法參照文獻[17]。

將提取好的樣品用Agilent 1260 高效液色譜儀測定。 首先，打開儀器及軟件，使其運行穩(wěn)定；其次，設置測定參數(shù)（種子泵流速為0.8 mL·min－1，其它組織泵流速為0.6 mL·min－1， 進樣量50 μL，柱溫箱溫度55 ℃，DAD 檢測器波長272 nm，分析時間與棉酚標準樣品一致）；最后，測定棉酚標準品獲得標準曲線后，測定樣品中的棉酚含量。 實驗設置3 個生物學重復。

1.3.6田間農(nóng)藝性狀測定。株高測定：測量單株子葉節(jié)到主莖頂端的距離，精確到0.1 cm。籽指測定：隨機挑選3 組100 粒飽滿的棉花種子，稱重后取平均值，精確到0.1 g。 纖維品質(zhì)測定：保持儀器測定室房間溫度在21 ℃， 濕度在60%左右。 放入樣品（一般10 g，不得低于8.5 g）到測定室，在溫度21 ℃，濕度60%的情況下平衡36～48 h 后使用纖維品質(zhì)測定儀HFT9000 對樣品進行測定。

轉(zhuǎn)基因植株后代的油分測量：將濃硫酸脫絨后的種子晾曬2～3 d，取飽滿的種子用核磁共振分析儀測量。 首先，打開儀器，使其運行穩(wěn)定，溫度保持在30 ℃；其次，定標曲線；最后稱量種子重，進行測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花遺傳轉(zhuǎn)化、陽性鑒定及Southern 雜交

選取GhCAD1-A的361 bp 干涉區(qū)段進行干涉載體構(gòu)建， 構(gòu)建好的PαGlob-GhCAD1-A-RNAi 載體見圖1A，將其電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101 中，再用農(nóng)桿菌介導的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Jin668 中進行遺傳轉(zhuǎn)化，得到123 個T0轉(zhuǎn)基因植株。分別提取正常生長并結(jié)種的T0轉(zhuǎn)基因植株的DNA 進行PCR 陽性檢測， 陽性率為91.9%（圖1B）。 選取部分T1轉(zhuǎn)基因植株進行Southern 雜交，以確定其拷貝數(shù)，來自于T0單株R4 的3 個單株R4-1、R4-5、R4-7 均為單拷貝， 且條帶大小一致，R7-3 為4 拷貝，R9-1 和R12-1 為雙拷貝（圖1C），后續(xù)用R4-1、R4-5、R4-7、R7-3、R9-1 和R12-1 表示其后代株系。

圖1 PαGlob-GhCAD1-A-RNAi 載體（A）、T0 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測（B）和T1 轉(zhuǎn)基因植株Southern 雜交（C）

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的基因表達量測定

取6 個T1轉(zhuǎn)基因單株（R4-1、R4-5、R4-7、R7-3、R9-1、R12-1）的種子進行田間種植至T3，取6個T3轉(zhuǎn)基因植株開花后35 d 的胚珠和葉片組織，分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后通過qRT-PCR對轉(zhuǎn)基因植株中的GhCAD1-A基因及其上游基因GhFPS、 下游基因GhCYP706B1 進行表達量的測定。 結(jié)果如圖2 所示，在轉(zhuǎn)基因植株的胚珠中Gh-CAD1-A及上游GhFPS 基因表達量在干涉株系中表達量均顯著降低（圖2A―B）,下游GhCYP706B1基因表達量有一定程度的降低（圖2C）。 不同轉(zhuǎn)化事件中干涉效果有所差異，且在同一轉(zhuǎn)化事件的不同單株間干涉效果也存在一定的差異。 而Gh-CAD1-A、GhFPS、GhCYP706B1 基因在轉(zhuǎn)基因植株的葉片中均沒有顯著性降低（圖2D―F），說明種子特異性啟動子在轉(zhuǎn)基因胚珠中發(fā)揮了作用。

圖2 T3 轉(zhuǎn)基因株系中GhCAD1-A 及相關基因的表達量檢測

2.3 轉(zhuǎn)基因植株腺體的觀察及棉酚含量測定

將篩選出來的6 個轉(zhuǎn)基因材料的成熟種子置于常溫水中，待種子吸脹后剝?nèi)シN皮，在體視顯微鏡下對種子進行觀察，結(jié)果如圖3A-G（見封三）所示，干涉材料種子色素腺體顏色變淺。 從圖中也可以看出在不同的干涉材料中，色素腺體的顏色也有所區(qū)別，且與棉酚含量呈正相關，比如R4-7 的棉酚含量比R7-3 高，R4-7 種子表面的色素腺體的顏色要稍高于R7-3。

提取T3轉(zhuǎn)基因植株的6 個不同材料中的種子棉酚進行測定，結(jié)果如圖3H（見封三）所示，與野生型Jin668 的種子棉酚含量相比， 不同干涉株系的種子棉酚含量均顯著降低，其中干涉效果最好的株系R4-5 種子棉酚含量比野生型降低了49.87%，棉酚含量為2.75 μg·mg－1。

分別提取T3不同轉(zhuǎn)基因植株的葉片、 花萼、花蕾、花瓣4 個組織中的棉酚，測定結(jié)果如圖4 所示，不同轉(zhuǎn)基因植株中葉片、花萼、花蕾、花瓣4 個組織的棉酚含量，與野生型Jin668 相比并沒有顯著性降低。在同一單株的不同組織中，棉酚含量有比較大的差異，葉片和花萼中的棉酚含量最少，棉酚含量平均僅為0.3 μg·mg－1，而花蕾和花瓣組織中棉酚含量較高，其中花瓣中的棉酚含量可達葉片棉酚含量的百倍。 這種只降低種子中的棉酚含量而不影響其它組織棉酚含量的結(jié)果跟預期是一致的。

圖4 T3 轉(zhuǎn)基因植株不同組織棉酚含量測定

2.4 轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀考察

對篩選出來的6 個T3轉(zhuǎn)基因植株進行了農(nóng)藝性狀考察，其中包括株高、籽指和纖維品質(zhì)等性狀的測定。 6 個轉(zhuǎn)基因植株與野生型Jin668 相比，所考察的農(nóng)藝性狀沒有顯著性差異（表2），這表明干涉目的基因表達不影響棉花植株的正常生長。

表2 T3 轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

3 討論

杜松烯合酶CAD1 是棉酚合成路徑中的限速酶，其產(chǎn)物（＋）-δ- 杜松烯是棉酚及其衍生物合成的基本骨架[8]，選擇CAD1 基因進行干涉，理論上在降低棉酚含量上會有很好的效果。

本研究中干涉效果較好的植株種子棉酚含量為2.75 μg·mg－1。 與Sunilkumar 等[8]的研究相比，本研究所創(chuàng)造的干涉材料種子棉酚含量降低幅度較小，可能是干涉片段的選擇。 本研究使用的干涉片段長度為361 bp， 而Sunilkumar 等所選的干涉片段長度為601 bp， 且其多出的片段靠近5' 端的區(qū)域，沉默效果更好。在本研究中，不同的株系表達量有所差異，且來自于同一株系的不同單株間的表達量也有差異的。這是RNAi 技術自身的局限性所致，RNAi 載體所產(chǎn)生的dsRNA 只能在轉(zhuǎn)錄水平上較大程度地沉默靶基因的表達，而不能在基因水平上對其起作用，這就造成了不同轉(zhuǎn)基因株系間表達量的差異[18]。 理論上來說，表達量降低得越多，棉酚含量降低越明顯，而在本研究中，有些單株表達量的變化跟棉酚含量的變化不呈正比，這可能是因為棉酚含量易受外界環(huán)境如溫度、水分、病蟲害等影響。

4 結(jié)論

本研究選擇通過種子特異啟動子驅(qū)動的干涉載體對GhCAD1-A基因進行干涉， 獲得了種子棉酚含量顯著降低，而其它組織棉酚含量不變，且對其它主要農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)無顯著影響的轉(zhuǎn)基因材料，獲得的轉(zhuǎn)基因植株種子棉酚含量降幅達到15.27%～49.87%。