周資凱，鄭柳，鮑益帆，楊麗，章志遠(yuǎn)

（1.南昌大學(xué)環(huán)境資源與化工學(xué)院，南昌 330031； 2.臺州市臺環(huán)環(huán)境檢測科技有限公司，浙江臺州 318020）

人體中的色氨酸和犬尿氨酸代謝途徑已被證實(shí)與許多疾病和失調(diào)有相關(guān)聯(lián)性，如人類免疫缺陷病毒的感染、亨廷頓病、阿爾茨海默病和精神分裂癥［1-2］。色氨酸先經(jīng)色氨酸-2，3-雙加氧酶（tryptophan-2，3-dioxygenase，TDO）催化，再經(jīng)吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）和犬尿氨酸甲酰胺酶氧化代謝為犬尿氨酸。研究表明，色氨酸存在于紅肉類、乳制品和豆制品食物中，人體可從飲食或保健品中獲取。色氨酸為人體多種重要生物活性分子的前驅(qū)物質(zhì)，其代謝過程及代謝產(chǎn)物犬尿氨酸與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，保持體內(nèi)色氨酸的代謝平衡對人體健康有著重要意義，因此定量測定體內(nèi)色氨酸及犬尿氨酸含量，對相關(guān)疾病的診斷治療具有重要價值。

色氨酸和犬尿氨酸常用的分析方法是高效液相色譜法搭配不同的檢測器，如紫外光檢測器［3-5］、熒光檢測器［6-7］、二極管陣列檢測器［8-10］、電化學(xué)檢測器［11-12］和串聯(lián)質(zhì)譜檢測器等［13-18］。串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏和絕佳的選擇性，是目前試驗(yàn)生物基質(zhì)樣品檢測的首選。生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，常用的前處理方法有有機(jī)溶劑液相萃取［15，18］、固相萃?。?2-14］、固相微萃取和液相微萃 ?。?9］等。為了提高靈敏度有時也進(jìn)行衍生化液相微萃取［17］，但具有成本高，耗時長，樣品損失多，選擇性不佳和波峰分辨率不足甚至變形等缺點(diǎn)，不利于大量多通道樣品的檢測。

在藥物動力學(xué)研究中，因某些藥物代謝的研究需去除色氨酸以對比犬尿氨酸的變化，從而判斷藥物作用，這種方法需要對大量生物樣本進(jìn)行研究。此外，考慮到色氨酸在營養(yǎng)食品中的添加狀況，需在低濃度線性范圍測定，因此有必要建立較寬的檢測范圍和簡便的凈化提取方式。在利用LC-MS／MS法對人和大鼠血漿進(jìn)行研究的文獻(xiàn)報道中［13-18］，文 獻(xiàn)［14］方法測定色胺酸、犬尿氨酸的濃度分別為0.018～0.282，0.017～0.276 μmol／L，可應(yīng)用的測定范圍有限；文獻(xiàn)［18］方法測定色胺酸、犬尿氨酸的最低定量限分別為100，25 μg／L，殘留基質(zhì)會影響方法靈敏度。筆者建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）法同時測定和驗(yàn)證大鼠血漿中的色氨酸和犬尿氨酸，使用血液基質(zhì)樣本，因此更容易適用于其它基質(zhì)（血清、尿液等）樣品。該方法測定范圍廣，是一種快速、靈敏、簡便的生化分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：6130 型，配有1200 G1329 自動進(jìn)樣器，1200 G1322A 真空裝置，1200 G1311A 二元泵，1200 G1316A 進(jìn)樣和管柱溫控裝置，1200 MSD 單四級桿質(zhì)譜檢測器（G1948B 電噴霧離子源），04.01B 版化學(xué)工作站，美國安捷倫科技有限公司；

臺式離心機(jī)：Allegra 6R 型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

色氨酸：純度不小于99.0 %，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

犬尿氨酸：純度不小于98.0 %，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯：純度為96.0%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

甲酸：ACS 級，純度為98%～100%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

活性碳：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

乙腈：色譜純，純度為99.9%，美國John Town send Baker；

甲醇：色譜純，純度為99.9%，美國Macron Fine Chemicals；

高氯酸：ACS 級，純度為70.0 %，日本Showa Chemicals Industry；

去離子水：R≥18 MΩ，Milli-Q 純水制造系統(tǒng)生產(chǎn)，美國默克密理博有限公司，用于制備所有溶液。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C8 型（150 mm× 4.60 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；流動相：A 相為0.20%甲酸水溶液，B 相為乙腈；梯度洗脫程序：0.00～0.50 min 為85% A，1.00～3.00 min 為45% A，3.60～5.00 min 為85% A；流量：1.20 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧（ESI）；毛細(xì)管電壓：3 000 eV；碎片電壓：70.0 eV；干燥氣體：氮?dú)?，流量?2.5 L／min；噴霧器壓力：345 kPa；干燥溫度：350℃；管柱溫度：25℃；色氨酸、犬尿氨酸及EHQC 離子碎片特征離子：分別為205.1，209.1 和218.0m／z。

1.3 血漿樣品前處理

收集大鼠血漿利用活性碳凈化去除色氨酸。向1.00 mL 血漿中加入50.0 mg 活性碳混合，在室溫下震蕩0.5 h，然后以15 000 r／min 離心10.0 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈微量離心管中，制成空白大鼠血漿于-80℃存放待用［20］。

取40.0 μL 上述空白大鼠血漿加入25%高氯酸10.0 μL，0.2%甲酸50.0μL（或標(biāo)準(zhǔn)品溶液）和200 μg／L 4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯10.0μL，漩渦混合10.0 s，室溫下以15 000 r／min 離心10.0 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈微量離心管內(nèi)待用。

1.4 溶液的配制

色氨酸和犬尿氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別取適量色氨酸和犬尿氨酸，用0.2%甲酸溶液溶解，制備成質(zhì)量濃度均為1.00 mg／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯溶液：取適量4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯，用甲醇-水（1∶100）混合液溶解制成質(zhì)量濃度為10.0 mg／L 的4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯溶液，然后稀釋成質(zhì)量濃度為200 μg／L 的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用空白大鼠血漿對色氨酸和犬尿氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行連續(xù)稀釋，制成質(zhì)量濃度均分別為0.500，1.00，5.00，10.0，50.0，100，500，1.00×103，5.00×103，1.00×104μg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

質(zhì)控樣品：向空白大鼠血漿中加入適量已知濃度的色氨酸、犬尿氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，制備成質(zhì)量濃度均分別為2.00，40.0，80.0，800，8.00×103μg／L的質(zhì)控樣品。

1.5 穩(wěn)定性考察

凍融循環(huán)穩(wěn)定性：取5 組質(zhì)控樣品分別在4℃和-80℃下進(jìn)行5 次凍融循環(huán)，然后進(jìn)行測定，考察該條件下的穩(wěn)定性。

室溫穩(wěn)定性：將配制好的質(zhì)控樣品分別在室溫下保存3，6，9，12，15，36，48，60，72，84，96，108，120 h，然后進(jìn)行測定，考察該條件下的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法選擇

生化樣品常見的快速脫蛋白和去基質(zhì)干擾的前處理方法是直接加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀反應(yīng)［10，12，17-18，20-21］，再剝離取上清液。研究發(fā)現(xiàn)這種方式會導(dǎo)致靈敏度降低，且選擇性不足，以及色譜峰拖尾和滯留時間延長［15-16，18］。據(jù)文獻(xiàn)［20］介紹，活性碳可吸附血漿中絕大部分生物基質(zhì)?？疾煜?.00 mL 血漿樣品中加入不同量（25.0，50.0 和75.0 mg）的活性炭，經(jīng)過不同混合時間（0.5，1，2，4，6 和24 h）后進(jìn)行測定。其中，混合24 h 與混合6 h的試驗(yàn)結(jié)果相比已無明顯優(yōu)化，因此不再考慮。其它條件下試驗(yàn)結(jié)果圖1 所示。

由圖1 可知，活性炭添加量為75.0 mg，混合時間為6 h 時純化效果最佳，但是其色氨酸與LOD 比值與50 mg 混合0.5 h 差異不明顯，對測定結(jié)果影響不大?？紤]減少總耗時，并對后續(xù)分析無明顯影響的原則，選擇活性炭添加量為50 mg，混合時間為0.5 h。優(yōu)化后的前處理可以獲得較低的檢出限和定量限，可快速，簡便的獲取大量優(yōu)質(zhì)純化血漿樣品。

圖1 活性碳添加劑量與混合時間對空白血漿中色氨酸吸附的影響

在1.2 儀器工作條件下，對空白大鼠血漿樣品進(jìn)行測定并評估方法特異性，將空白血漿樣品中色氨酸和犬尿氨酸的色譜峰面積與質(zhì)量濃度為0.200 μg／L 的樣品溶液對應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可知，空白血漿樣品中測定的色譜峰面積僅為檢出限試驗(yàn)樣品對應(yīng)色譜峰面積的6.43%（被測物含量小于檢出限的20.0%），表明前處理方法對于色氨酸和犬尿氨酸具有有效特 異性。

表1 空白血漿與檢出限試驗(yàn)樣品色譜峰面積（n=6）

2.2 緩沖溶液的選擇

為得到更好的分析物峰形，對同濃度下不同緩沖液（乙酸鈉、硼酸鈉、磷酸鹽、乙酸銨和甲酸溶液）進(jìn)行了平行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用0.2 %甲酸溶液可獲得最佳分辨率和最尖銳的波峰，同時發(fā)現(xiàn)緩沖溶液中某些離子與分析物會發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，導(dǎo)致色譜圖出現(xiàn)寬峰，影響分離結(jié)果，而甲酸可有效增加分析物離子化程度［20］。綜合上述條件，色氨酸和犬尿氨酸的測定滯留時間分別為2.71，2.07 min。大鼠血漿的質(zhì)控樣品色譜圖如圖2 所示。在優(yōu)化好的最佳條件下，總分析時間小于4.00 min。

圖2 大鼠血漿的質(zhì)控樣品色譜圖

2.3 線性關(guān)系與檢出限

在1.2 儀器條件下，對系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算線性方程與相關(guān)系數(shù)R2。用全空白血漿（只加入4-羥基-2-喹啉羧酸乙酯）進(jìn)行基質(zhì)測定，以3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限，以10 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算定量限。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限列于表2。

表2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

由表2 可知，待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度在 0.500～ 1.00×104μg／L 的范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，可應(yīng)用于多數(shù)生物基質(zhì)樣本的分析。

據(jù)文獻(xiàn)報道，測定色氨酸和犬尿氨酸的檢出限分別為4.23～7.21，0.0250～3.60 μg／L，測定色氨酸和犬尿氨酸的定量限分別為8.46～500 和9.81～25.0 μg／L［12-17］，對比表3 可知，本方法靈敏度高，適合運(yùn)用于生物基質(zhì)樣品中的分析檢測

2.4 精密度試驗(yàn)

將凈化好的血漿樣品配制高中低3 種不同濃度進(jìn)行測定，將樣品按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果列于表3。由表3 可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.7%，表明該方法測定色氨酸和犬尿氨酸精密度良好。

表3 大鼠血漿中分析物的精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

以凈化處理過的空白血液樣品為基底進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，色氨酸和犬尿氨酸的平均回收率數(shù)據(jù)列于表4。由表4 可知，色氨酸和犬尿氨酸的平均回收率分別為99.2%～101%和100%～102%。結(jié)果表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表4 大鼠血漿樣品的絕對回收率（n=5）

2.6 穩(wěn)定性考察

按1.6 方法對兩種成分濃度均為2.00 μg／L的樣品在4，-80℃下進(jìn)行凍融循環(huán)穩(wěn)定性試驗(yàn)，以及在室溫120 h 內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果列于表5和表6。由表5 和表6 可知，大鼠血漿樣品在4℃和-80℃下凍融循環(huán)，以及室溫120 h 內(nèi)表現(xiàn)極為穩(wěn)定，沒有顯著降解和其它變化，存儲過程中使用不含或含極少量的有機(jī)溶劑，也能夠有效幫助樣品儲備溶液長期保存，對復(fù)雜的生物基質(zhì)樣品前處理方法具有重要性。

表5 大鼠血漿樣品凍融循環(huán)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表6 大鼠血漿室溫放置120 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 結(jié)語

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定大鼠血漿中色氨酸和犬尿氨酸，優(yōu)化了適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理方法，有效地解決了生物基質(zhì)對試驗(yàn)結(jié)果的影響。此方法可為藥物動力學(xué)相關(guān)研究提供參考。與文獻(xiàn)方法［13-18］相比，本方法可達(dá)到與文獻(xiàn)報道的方法相同甚至更佳的結(jié)果，全過程幾乎不需要有機(jī)溶劑或有毒溶液，污染小，廢棄物少，相對更綠色環(huán)保，節(jié)省時間和經(jīng)濟(jì)成本，效益極高，樣品溶液穩(wěn)定性好。該凈化方法和分析方法已成功應(yīng)用于人類、小鼠、狗的血漿處理與分析。