郭華軍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

嫁接技術(shù)作為廣泛應(yīng)用的無性繁殖方式之一，可顯著增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力和病蟲害的抵抗能力，改進(jìn)株型，使優(yōu)良栽培品種短時(shí)間內(nèi)得到擴(kuò)繁，并有效提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。嫁接能有效保持母本的優(yōu)良性狀，已成為良種化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。嫁接技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域的擴(kuò)繁、新品種選育、品種改良等方面，其研究水平也從宏觀逐漸發(fā)展至微觀,對(duì)嫁接機(jī)制的研究目前已取得階段性成果[1]。選擇優(yōu)良的砧木是培育優(yōu)良植物的重要環(huán)節(jié)，目前生產(chǎn)上所用砧木多系野生或半野生類型，具有較強(qiáng)且廣泛的適應(yīng)能力，如抗寒、抗旱、抗?jié)?、耐鹽堿、抗病蟲等。因此開展砧木與接穗間相互作用機(jī)制的研究，對(duì)于科學(xué)選擇砧穗組合具有重要意義。筆者從水分和礦質(zhì)離子、有機(jī)物和抗氧化酶、激素作用、基因調(diào)控和表觀遺傳學(xué)等方面綜述了砧穗互作的研究現(xiàn)狀，以供后續(xù)相關(guān)研究參考。

1 砧木對(duì)接穗水分和礦質(zhì)離子營養(yǎng)利用的影響

選擇砧木時(shí)常選用根系發(fā)育良好、抗性強(qiáng)的品種或近緣物種。砧木根冠比大、吸收能力強(qiáng)，能有效提高水分的吸收效率及對(duì)芽的供水量，還能促進(jìn)營養(yǎng)元素的攝取、易位和同化，從而提高使用效率。薛亮等[2]研究表明，與自根苗相比，甜瓜嫁接苗的氮利用量增加5.2%，果實(shí)的氮利用率提高20.9%。韓曉燕[3]研究表明，嫁接增加黃瓜幼苗傷流液中K+、Ca2+、Mg2+含量，顯著提高黃瓜幼苗的前期長(zhǎng)勢(shì)，嫁接植株產(chǎn)量顯著高于自根苗。嫁接植株耐鹽性主要取決于砧木[4-5],而不是接穗[6]。嫁接苗對(duì)根部Na+、K+向上運(yùn)輸具有選擇性，通過減少地上部分Na+含量和Na+/K+比值提高植株的耐鹽性[7-9]。嫁接植株的抗旱性也主要取決于砧木，且砧木的抗旱性可以傳導(dǎo)給地上部[10-11]。嫁接植株低溫弱光耐性明顯強(qiáng)于自根植株[12-13]。對(duì)蘋果、葡萄、柑桔、梨和核桃等的研究發(fā)現(xiàn)，砧木通過調(diào)節(jié)水分、營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的運(yùn)輸影響接穗的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力和抗病蟲害能力[14-18]。王怡玢[19]對(duì)嫁接蘋果的研究發(fā)現(xiàn)，富士(Fuji)/M9-T337的葉片與短枝頂芽中的N、P、K含量均顯著高于富士扦插苗，M9-T337矮化砧木對(duì)富士蘋果各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的降幅達(dá)28.9%～74.5%，明顯減弱了樹勢(shì)，縮短了幼樹成形時(shí)間。接穗對(duì)砧木生長(zhǎng)的影響相關(guān)研究報(bào)道較少。周開兵等[20]研究了柑橘接穗對(duì)砧木生長(zhǎng)、根系活力的影響結(jié)果表明，Swingle枳柚和紅桔+粗檸檬的砧木直徑易受接穗影響，接穗顯著影響砧木根系體積；一般情況下，嫁接后砧木根系活力低于未嫁接砧木，或與其差異不顯著[21]。焦妍妍[22]的研究表明，鉀高效基因型西瓜“勇士”作為接穗可以促進(jìn)鉀低效基因型西瓜“早佳8424”根系的生長(zhǎng)和鉀吸收能力；反之，以“早佳8424”作為接穗降低“勇士”根系的生長(zhǎng)和鉀吸收能力，這種反饋在低鉀脅迫下表現(xiàn)得更明顯。郭學(xué)民等[23]以毛桃(P.persica)為砧木,“21世紀(jì)”桃為接穗嫁接后發(fā)現(xiàn),接穗能使砧木根系導(dǎo)管分子的類型與直徑發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)營養(yǎng)的吸收和運(yùn)輸產(chǎn)生影響。

2 砧木對(duì)接穗有機(jī)物含量和酶活性的影響

砧木嫁接可影響植株的抗熱性能，這與植株中一系列生理代謝活動(dòng)有關(guān)。韓曉燕[3]在黃瓜嫁接研究中發(fā)現(xiàn)，嫁接后果實(shí)中含水量、可溶性糖含量無差異，可溶性蛋白、游離氨基酸含量增加，Vc含量降低；葉片中含有更多的脯氨酸(Pro)和可溶性糖，氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性較高，抵御溫度脅迫的能力更強(qiáng)。嫁接增強(qiáng)了黃瓜幼苗葉片的凈光合速率，顯著提高了PSⅡ中用于光化學(xué)效率的傳遞電子數(shù)量、黃瓜幼苗葉片的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，具有更高的根系活力及氣體交換能力，這與范雙喜等[24]的研究結(jié)果一致，但葉片中抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性明顯提升。陳晨[25]研究發(fā)現(xiàn)，嫁接番茄苗葉片和果實(shí)中谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酸脫氫酶(GDH)的活性顯著高于自根苗，蛋白氮、游離氨基酸態(tài)氮、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量也顯著提高，說明嫁接通過提高植株氮代謝酶活性而提高對(duì)無機(jī)氮的吸收利用效率，促進(jìn)番茄體內(nèi)的氮同化及有機(jī)氮的合成；葉片中蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)、中性轉(zhuǎn)化酶(NI)活性變化趨勢(shì)相似；除以上表現(xiàn)外，有的嫁接苗果實(shí)中可溶性糖、番紅素含量顯著提高，不同砧木表現(xiàn)不同。對(duì)茄子、黃瓜、甜瓜以及菊花的研究發(fā)現(xiàn)，某些植株還可以增加體內(nèi)乙酰水楊酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質(zhì)的含量[26-28]。賈梯[29]的研究發(fā)現(xiàn),嫁接砧木對(duì)接穗矮化作用越明顯，葉片柵欄組織越厚，進(jìn)而影響光合作用。

在嫁接苗抗鹽性能方面，有研究認(rèn)為嫁接苗葉片光合特性參數(shù)、保護(hù)酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量提高，而電解質(zhì)滲漏率和丙二醛含量降低的多種表現(xiàn)均與抗鹽有關(guān)[30-33]。而劉正魯?shù)萚32]認(rèn)為,嫁接苗的抗鹽性是由于保持較快的抗壞血酸谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)循環(huán)的原因。部分學(xué)者研究認(rèn)為鹽脅迫下嫁接苗葉片中多胺含量、根系中腐胺和精胺是植株抗鹽的重要特征物質(zhì)或重要的抗鹽相關(guān)物質(zhì)[34-37]。

關(guān)于接穗對(duì)砧木的有機(jī)物成分和抗氧化酶的影響，王淑杰等[21]通過對(duì)幾個(gè)葡萄主栽品種的研究表明,嫁接苗根系POD活性明顯高于自根苗，可溶性糖和可溶性蛋白含量明顯低于自根苗。周開兵等[20]研究表明,柑橘嫁接后砧木POD和SOD活性低于未嫁接砧木，或與其差異不顯著,但存在接穗促進(jìn)根系過氧化氫酶(CAT)活性升高的現(xiàn)象。由此推測(cè)，受接穗的影響，砧木生理活性下降，其抗逆性可能也有所下降。

3 砧木對(duì)接穗激素類物質(zhì)合成的影響

嫁接影響植株中激素類物質(zhì)的合成。齊紅巖等[38]研究發(fā)現(xiàn)，嫁接甜瓜根中具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育功能的激素(ZT，GAs)含量增加，而脫落酸(ABA)的含量下降，從而使莖蔓生長(zhǎng)快，葉片數(shù)增多，植株粗壯。KATO等[39]對(duì)茄子嫁接苗與自根苗傷流液中激素含量的研究表明，嫁接苗細(xì)胞分裂素含量的高低取決于砧木種類，砧木“VF”的3個(gè)品種茄子嫁接苗傷流液中，其含量均明顯高于自根苗；而無論何種砧木與3個(gè)茄子品種嫁接后，傷流液中赤霉素和生長(zhǎng)素含量均較自根苗高。韓敏40]研究認(rèn)為，砧木可能通過影響接穗中IAA和SA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響其耐冷性，接穗則可能通過影響砧木的ET、CK和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響其耐冷性。接穗影響砧木激素含量的研究中，焦妍妍[22]的研究表明，鉀高效基因型西瓜“勇士”作為接穗可以促進(jìn)鉀低效基因型西瓜“早佳8424”根系的ABA和IAA內(nèi)源激素水平；反之，以“早佳8424”作為接穗則降低“勇士”根系A(chǔ)BA和IAA內(nèi)源激素水平，這種反饋在低鉀脅迫下表現(xiàn)得更明顯。

在嫁接親和性研究中，多數(shù)研究表明IAA在嫁接口愈合過程中發(fā)揮了決定性作用。MELNYK等[41]認(rèn)為，擬南芥嫁接口愈合過程中韌皮部重連先于木質(zhì)部重連,這是因?yàn)榻铀胫械腎AA通過ALF4(aberrant lateral root formation 4)刺激生長(zhǎng)素受體TIR1/AFBs (transport inhibitor response 1/auxin signaling F-box)和AXR1(auxin-resistant 1)，進(jìn)而激活A(yù)ux/IAA-ARF(aux/IAA-auxin response factor)響應(yīng)，最終使韌皮部重連；研究還發(fā)現(xiàn)，相比于IAA，CTK和ETH對(duì)于擬南芥接口愈合中韌皮部重連的作用微弱，這可能是因?yàn)榧藿佑线^程復(fù)雜，對(duì)植物激素的需求也因組織而異。ASAHINA等[42]認(rèn)為，子葉合成的GA及來自砧木的微量元素對(duì)黃瓜和番茄切開的莖部愈合是必需的，并且外源GA可以緩解因嫁接摘除子葉造成的莖部愈合緩慢現(xiàn)象。另有研究[43]表明，創(chuàng)傷反應(yīng)還可誘導(dǎo)植物激素促進(jìn)接口愈合,創(chuàng)傷誘導(dǎo)的乙烯和茉莉酸分別通過調(diào)節(jié)ANAC071(Arabidopsis NAC domain containing protein 71)和RAP2.6L(At5g13330)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)，促進(jìn)上下界面的愈合。殷昊[44]通過使用生長(zhǎng)素特異響應(yīng)植株DR5:GUS進(jìn)行了擬南芥嫁接研究表明，生長(zhǎng)素對(duì)于接口部位維管組織的重新連接具有重要作用，乙稀以及茉莉酸很可能在接穗和砧木之間的細(xì)胞間通訊過程中相互協(xié)同，在細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)的重建過程中發(fā)揮功能。另外，植物激素還可能通過影響砧木和接穗維管束橋形成的時(shí)間和數(shù)目調(diào)控植株的發(fā)育[45]。

激素不僅影響嫁接組合發(fā)育，也影響接穗的生長(zhǎng)勢(shì)和樹形，該方面報(bào)道較多，是研究熱點(diǎn)之一。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量及比例會(huì)影響枝條類型構(gòu)成[46]。植物內(nèi)源激素的平衡是調(diào)控樹形的重要因素之一[47]，王磊[48]通過對(duì)不同株型桃樹枝葉內(nèi)源激素不同時(shí)期的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，7月時(shí)垂枝型枝條上側(cè)GA、IAA、ZR含量明顯高于下側(cè)，而ABA含量為枝條上側(cè)低于下側(cè)，從而使其生長(zhǎng)速度低于中部上側(cè)，枝條發(fā)生彎曲。還有一些激素如獨(dú)角金內(nèi)酯、赤霉素可能是通過調(diào)控頂端優(yōu)勢(shì)控制植物株型[49]。因此砧木對(duì)接穗激素水平的影響帶來了顯著的效果。王麗琴等[50]認(rèn)為，蘋果緊湊型品種和矮化型品種具有不同的激素調(diào)節(jié)機(jī)制,GA、CTK在緊湊型品種矮化中起重要作用，而矮砧的矮化可能與IAA密切相關(guān)。王怡玢[19]的研究發(fā)現(xiàn)，受M9-T337矮化砧木的影響，富士蘋果Fuji/M9-T337中IAA在砧木韌皮部發(fā)生積累，其他內(nèi)源激素在Fuji/M9-T337中的含量也受其調(diào)節(jié)。一般認(rèn)為激素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響不是單一分裂的，(CTK+IAA+GA)/ABA值越低，樹體矮化性越明顯，反之則越喬化。張寶娟等[51]研究發(fā)現(xiàn)，富士蘋果不同砧穗組合的樹體中內(nèi)源激素含量與其易成形性有一定關(guān)聯(lián)，并證明主要是IAA、ZR和GA3等在這一過程中發(fā)揮了重要作用。張東等[52]以蘋果生產(chǎn)上8種常見砧穗組合為材料，發(fā)現(xiàn)不同砧穗組合的幼樹在分枝數(shù)、短枝比例上均有一定差異。ZHOU等[53]研究了黃瓜嫁接體中的細(xì)胞分裂素的作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素從砧木運(yùn)輸?shù)浇铀牒蟠龠M(jìn)了葉綠體的合成，同時(shí)降低其木質(zhì)部的ABA含量。激素在花芽分化、成花機(jī)理及花芽性別分化方面的作用已為人們所熟知，研究報(bào)道較多的激素類物質(zhì)主要為CTK、GA和ABA[54]。嫁接可能通過影響接穗中激素物質(zhì)的合成而影響其生殖生長(zhǎng)。官春云[55]發(fā)現(xiàn)，已春化的油菜砧木上嫁接未春化的接穗，植株仍然會(huì)開花，該現(xiàn)象是由于已春化砧木內(nèi)源赤霉素含量高且傳遞給接穗所致。傅遠(yuǎn)志等[56]也認(rèn)為，嫁接植株開花結(jié)實(shí)效應(yīng)高于自根植株，是因?yàn)榧藿幽艽龠M(jìn)接穗GA3等激素水平的提高。張東等[52]以蘋果生產(chǎn)上8種常見砧穗組合為材料，發(fā)現(xiàn)不同砧穗組合的幼樹在花芽數(shù)上有一定差異。張寶娟等[51]研究發(fā)現(xiàn),不同砧穗組合的樹體中內(nèi)源激素含量與其早花性有一定關(guān)聯(lián)，并證明IAA、ZR和GA3等在這一過程中發(fā)揮了重要作用。王怡玢[19]研究表明，嫁接矮化砧木M9-T337后，F(xiàn)uji/M9-T337短枝比例增加，營養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)得以更好的平衡，促進(jìn)了花芽形成。莖中IAA在砧木韌皮部發(fā)生積累，其他內(nèi)源激素在Fuji/M9-T337中的含量也受其調(diào)節(jié)。(CTK+IAA+GA)/ABA值越低，樹體矮化性越明顯，反之則越喬化。一般認(rèn)為GAs在多年生木本植物中對(duì)成花誘導(dǎo)有負(fù)調(diào)控作用，所以IAA和GAs含量降低，促進(jìn)了花芽分化。閆樹堂等[57]以3種不同矮化中間砧(B9、M26、SH38)紅富士蘋果為試驗(yàn)材料，研究幼果發(fā)育期間果實(shí)內(nèi)源激素(IAA、GA3、ZR 和ABA)含量的變化，結(jié)果表明：不同矮化中間砧不會(huì)改變紅富士蘋果果實(shí)發(fā)育初期內(nèi)源激素(ABA 除外)總體變化趨勢(shì)，但中間砧為B9、M26的幼果中IAA、ZR、GA3含量大部分時(shí)期比SH38中間砧的高。徐勝利等[58]認(rèn)為，嫁接果實(shí)中GA與ABA顯著低于自根處理，進(jìn)而對(duì)伽師瓜的糖積累與代謝造成影響。LOPEZ-GALARZA等[59-60]則認(rèn)為，嫁接番茄的品質(zhì)差異可能與砧木根系調(diào)控植株激素的合成和礦質(zhì)元素的吸收有關(guān)。

4 砧木對(duì)接穗的基因調(diào)控及表觀遺傳學(xué)范疇的影響

激素作為調(diào)控因子，其調(diào)控作用往往與基因的轉(zhuǎn)錄活性直接關(guān)聯(lián)，眾多研究表明，激素與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控密不可分。陳哲[61]利用RNA-Seq技術(shù)分析了荔枝不同親和性組合愈合處愈合過程中基因表達(dá)譜的變化，篩選出與嫁接親和性相關(guān)的途徑有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、IAA合成和IAA信號(hào)相關(guān)途徑以及木質(zhì)素合成途徑。殷昊[44]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在嫁接后第2天其生長(zhǎng)素的分布發(fā)生了很大變化，在接穗和砧木的接口附近出現(xiàn)生長(zhǎng)素的積累，此時(shí)尚未形成新的維管束；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，從芯片數(shù)據(jù)得到的差異表達(dá)基因中，屬于糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族的SWEET15(AT5G13170)基因的表達(dá)量在所有上調(diào)基因中變化最大，推測(cè)蔗糖可能起到引發(fā)信號(hào)分子的作用。SAUER等[62-63]則認(rèn)為切口損傷誘導(dǎo)了生長(zhǎng)素受體蛋白PIN1基因表達(dá)量上升，導(dǎo)致PIN1在細(xì)胞中的分布極性發(fā)生改變。何文[64]分析了3個(gè)蜜柚嫁接組合在不同發(fā)育時(shí)期的基因轉(zhuǎn)錄水平，獲得與細(xì)胞分裂素、鐵運(yùn)輸、光合、生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素途徑相關(guān)的差異基因和一個(gè)未知功能的基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CgWRKY27啟動(dòng)子中包含ABA響應(yīng)元件，啟動(dòng)子中還包含乙烯和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，認(rèn)為CgWRKY27可能是枳砧“紅綿蜜柚”嫁接不親和關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，并提出了嫁接不親和機(jī)理的簡(jiǎn)易模型[64](圖1)。

WRKY家族基因參與植物不同激素信號(hào)通路，通過調(diào)控相關(guān)基因來響應(yīng)或調(diào)控植物激素信號(hào)。如WRKY基因通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率使植物對(duì)各種生物/非生物脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[65-67]。王怡玢[19]發(fā)現(xiàn)富士蘋果嫁接苗Fuji/M9-T337中與激素有關(guān)基因在根系和葉片各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量普遍介于Fuji和M9-T337扦插苗之間。IAA的含量與MdYUCCA10a基因(MdYUCCA10a是IAA合成的限速酶，能將吲哚-3丙酮酸轉(zhuǎn)化為IAA)的表達(dá)量存在著明顯的對(duì)應(yīng)滯后性關(guān)系，GAs含量與MdGA20ox基因(GA合成相關(guān)基因)的表達(dá)量也存在著明顯的對(duì)應(yīng)滯后性關(guān)系。說明砧木通過影響激素合成相關(guān)基因，改變接穗中的激素含量。另外還發(fā)現(xiàn)，頂芽中的成花誘導(dǎo)途徑整合因子MdSOC1和MdFT及其下游基因MdSPL9、蔗糖合成相關(guān)基因MdTPS1和MdTPS2以及糖代謝相關(guān)基因MdSUSY1的表達(dá)量較Fuji扦插苗均有增加。安娜[54]利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)分析了長(zhǎng)富2號(hào)/M9嫁接苗嫁接口上、下10 cm處韌皮部的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)差異基因主要涉及光合、代謝、糖酵解、碳固定和果糖代謝等生物學(xué)過程，差異基因中的轉(zhuǎn)錄因子大部分屬于MADS-box家族蛋白，暗示MADS-box家族蛋白通過嫁接參與蘋果接穗成花調(diào)控中發(fā)揮重要作用；qRT-PCR結(jié)果表明生長(zhǎng)素原初響應(yīng)基因Aux/IAA家族成員MdIAA22(MD09G1202300)和MdIAA51(MD17G1183500)在嫁接口下10 cm處韌皮部的表達(dá)量顯著低于嫁接口上方，說明其具有通過嫁接參與接穗性狀調(diào)控的重要作用。

砧木影響接穗的生理代謝和生長(zhǎng)、生殖，接穗表現(xiàn)出部分砧木的生理特征或二者的中間性狀，而且這種性狀在嫁接苗后代個(gè)體中可以遺傳若干代，說明嫁接能產(chǎn)生可遺傳的變異，且變異具有趨砧性[68-69]。但是這種遺傳變異并不是砧木和接穗之間發(fā)生了核基因組水平交流導(dǎo)致的。研究者僅發(fā)現(xiàn)番茄和茄子異種嫁接接合部細(xì)胞染色體數(shù)目和倍性發(fā)生了變化，產(chǎn)生了非整倍體和多倍體細(xì)胞(2n=40，48，84)，接合部組織出現(xiàn)了砧木和接穗沒有的特征帶和親本特征帶丟失，更遠(yuǎn)距離的核基因的交流還未見報(bào)道[69]。王燕[70]通過small RNA測(cè)序在嵌合體的榨菜回復(fù)系(rTTT) 植株中檢測(cè)到了紫甘藍(lán)親本特異的小RNA，說明小RNA類遺傳信號(hào)物質(zhì)能在植物細(xì)胞之間移動(dòng)，不同譜系細(xì)胞間遺傳信號(hào)物質(zhì)的交流可能是誘導(dǎo)嫁接變異產(chǎn)生的重要原因之一。

基于以上認(rèn)識(shí)，人們自然把目光集中于表觀遺傳學(xué)研究。實(shí)際上許多植物激素的信號(hào)分子編碼基因同時(shí)也是miRNA的靶標(biāo)基因。在擬南芥中，已經(jīng)鑒定出23個(gè)ARF(auxin response factor)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有miRNA互補(bǔ)位點(diǎn)的ARF基因至少有5個(gè)，其中ARF10、ARF16和ARF17是miR160的靶基因，ARF6和ARF8是miR167的靶基因[71]。miR160通過調(diào)控ARF10和ARF16的表達(dá)影響擬南芥根冠細(xì)胞的形成，miR160與ARF10還參與生長(zhǎng)素和脫落酸對(duì)種子萌發(fā)的調(diào)控[72]。AIDA等[73-75]等發(fā)現(xiàn)miR164的靶基因編碼NAM/ATAF/CUC(NAC)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，包括NAC1、CUP-SHAPED COTYLEDON1(CUC1)、CUC2和ORESARA1(ORE1)等，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與傳遞生長(zhǎng)素信號(hào)，促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)，調(diào)控莖端分生組織的發(fā)生，調(diào)控細(xì)胞的老化死亡。反過來，很多轉(zhuǎn)錄因子通過控制基因的轉(zhuǎn)錄開關(guān)或表達(dá)量，參與到激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，由此形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)對(duì)生理活動(dòng)的精確控制。如荔枝LcWRKY1通過調(diào)控LcAOX1a的表達(dá)調(diào)控ABA的合成，進(jìn)而影響果實(shí)成熟[76]。某些WRKY作為正向調(diào)節(jié)因子參與到ABA介導(dǎo)的耐旱反應(yīng)，而某些WRKY則是種子萌發(fā)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[77]。香蕉MaWRKY1和MaWRKY2同時(shí)參與了MeJA途徑的調(diào)控[78]、金柑FcWRKY40參與了ABA信號(hào)通路的調(diào)控[79]、葡萄VqWRKY52調(diào)控SA途徑[80]、蘋果MdWRKY9參與了BR途徑調(diào)控[81]。

microRNA在嫁接苗中也調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答。李超漢[82]研究表明：黃瓜嫁接苗與南瓜嫁接苗中75%的已知miRNA的表達(dá)發(fā)生顯著變化。熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)10條已知miRNA、16條新miRNA以及19條靶基因的表達(dá)均發(fā)生了顯著變化，說明miRNA及其靶基因能響應(yīng)嫁接；同時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA參與黃瓜嫁接苗應(yīng)答干旱脅迫、鹽脅迫、缺氮或缺磷脅迫。與自根苗相比，多數(shù)靶基因的表達(dá)在黃瓜嫁接苗的葉片和根以及南瓜嫁接苗的根中下調(diào)，而在南瓜嫁接苗的葉片中上調(diào)，暗示了黃瓜嫁接苗和南瓜嫁接苗抗性的提高可能歸因于某些靶基因的下調(diào)表達(dá)。徐媛媛[83]研究發(fā)現(xiàn)，與實(shí)生苗相比，嫁接到資陽香橙和飛龍枳的錦橙葉片中與植株生長(zhǎng)、葉片發(fā)育和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的miR159、miR164、miR156、miR393的表達(dá)上調(diào)，表明嫁接可能影響接穗中與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá)。安娜[54]構(gòu)建了嫁接與不嫁接蘋果中6個(gè)組織部位的small RNA文庫，鑒定并篩選出砧穗間差異表達(dá)的miRNAs及其靶基因，初步提出mdm-miR156-MdSPLs、mdm-miR171-MdAP2、mdm-miR172-MdAP2、mdm-miR159-MdMYB等參與嫁接蘋果成花調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，隨后又構(gòu)建嫁接蘋果頂梢、韌皮部、幼果和根尖的RNA-seq文庫，篩選鑒定了砧穗間差異表達(dá)的lncRNA及其靶基因，發(fā)現(xiàn)3個(gè)參與砧穗間成花分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的lncRNA，進(jìn)一步篩選獲得目標(biāo)分子MdAGL24的上游調(diào)控因子和互作蛋白，利用轉(zhuǎn)基因番茄驗(yàn)證MdAGL24基因功能，最后構(gòu)建了以MdAGL24為核心、由miRNAs和lncRNAs參與形成的蘋果矮化砧木通過嫁接影響接穗成花的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

RNAi干擾技術(shù)為進(jìn)一步研究嫁接植株中信號(hào)分子的傳遞和運(yùn)輸提供了有力手段。通過RNAi干擾技術(shù)，李明等[84-85]研究表明，無論用RNAi型植株作為砧木或接穗，DEX誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因沉默信號(hào)均能導(dǎo)致相應(yīng)野生型擬南芥接穗或砧木KatB和KatC的mRNA的減少，說明基因轉(zhuǎn)錄后沉默信號(hào)可以通過嫁接面在擬南芥體內(nèi)雙向傳遞。ZHAO等[86]將構(gòu)建的李屬壞死環(huán)斑病毒短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA干擾載體轉(zhuǎn)入櫻桃砧木，再將非轉(zhuǎn)基因的甜櫻桃嫁接其上，最后在非轉(zhuǎn)基因接穗上檢測(cè)到干擾載體產(chǎn)生的小RNA，證實(shí)小RNA可以在木本植物的砧木和接穗之間長(zhǎng)距離(1.2 m)轉(zhuǎn)運(yùn)。徐媛媛[83]通過分析嫁接錦橙與實(shí)生苗RNA測(cè)序結(jié)果，篩選到一些嫁接后表達(dá)差異顯著的miRNA，用qRT-PCR驗(yàn)證其的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR395和chrUn_35093有可能在砧穗間轉(zhuǎn)移。焦妍妍[22]在鉀高效基因型西瓜“勇士”和鉀低效基因型西瓜“早佳8424”響應(yīng)低鉀的miRNA基因及其對(duì)應(yīng)的靶基因表達(dá)量分析中發(fā)現(xiàn)，miRNA156a和miRNA395b可能是嫁接西瓜接穗對(duì)砧木鉀吸收關(guān)聯(lián)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸miRNA。

小RNA分子運(yùn)輸機(jī)制的研究方面，LUCAS等提出了小RNA分子傳遞是通過基于大分子物質(zhì)的非細(xì)胞自治途徑(Non-cell Autonomous Pathway, NCAP)模型，在此模型中，RNA前體在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄，通過核孔運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，與一些特定的非細(xì)胞自治蛋白(Non-cell Autonomous Pathway Protein,NCAPP)相互識(shí)別并結(jié)合形成RNP(RNA-PROTEIN)復(fù)合分子，一部分RNA進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，另一部分RNP復(fù)合體結(jié)合胞間連絲處的載入蛋白后，胞間連絲根據(jù)蛋白復(fù)合體的大小調(diào)節(jié)自身的排阻限(Size Exclusion Limit，SEL)，使復(fù)合體通過胞間連絲由伴胞到達(dá)篩管；進(jìn)入篩管后隨韌皮部汁液集流由源至庫進(jìn)行運(yùn)輸。當(dāng)?shù)竭_(dá)合適的庫時(shí)，由一些特異的庫篩管識(shí)別蛋白將復(fù)合體進(jìn)行分配卸載，經(jīng)過一個(gè)類似的監(jiān)控區(qū)域(Surveillance Field，SurF)后，復(fù)合體到達(dá)目標(biāo)庫組織(根、莖、葉的頂點(diǎn)或其他的發(fā)育組織)，進(jìn)而發(fā)生一系列的如沉默靶基因、RNA的降解、翻譯成蛋白質(zhì)等生物過程，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[87]。

內(nèi)源非編碼的小RNA (siRNA)與CmPSP1(Pimpkine Phloem snall RNA binding protein 1)蛋白結(jié)合后可在細(xì)胞間擴(kuò)散，再經(jīng)維管組織長(zhǎng)距離運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性RNA沉默[88]。特異內(nèi)源mRNA(如PFP-LeT6和CmNACP mRNAs)在韌皮部產(chǎn)生，在細(xì)胞間擴(kuò)散，而后局部或系統(tǒng)性運(yùn)輸，與蛋白CmmPP16、CmRBP50結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體，調(diào)控RNA進(jìn)入特定靶位，直接控制基因表達(dá)或運(yùn)輸至目的組織[89]。利用南瓜韌皮部汁液以及嫁接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，某些小RNA分子能夠與一個(gè)韌皮部蛋白(Phloem Small-RNA Binding Protein 1, PSRP1)結(jié)合形成RNP復(fù)合體[90]，并且這個(gè)復(fù)合體受韌皮部蛋白激酶PSRPK1引發(fā)的磷酸化調(diào)控，使得其結(jié)合穩(wěn)定性增強(qiáng)，隨著韌皮部液流進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳遞[91]。很多擬南芥嫁接實(shí)驗(yàn)和煙草嫁接實(shí)驗(yàn)都證明siRNAs能夠通過韌皮部到達(dá)比較遠(yuǎn)的組織，進(jìn)而與靶基因結(jié)合引起相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄水平基因沉默或轉(zhuǎn)錄后基因沉默。成熟的miRNAs具有和siRNAs—樣的傳遞機(jī)理[92-93]。部分可運(yùn)輸?shù)男NA分子具有一定的序列特異性。馬鈴薯POTH1基因的mRNA3’-UTR區(qū)二級(jí)頸環(huán)結(jié)構(gòu)上富含CUCU區(qū)段能與StPTB6(RBP50同源基因)結(jié)合，可進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳遞。在南瓜中多聚嘧啶結(jié)合蛋白(PTB)能夠識(shí)別結(jié)合這一區(qū)域并且輔助mRNA的遠(yuǎn)距離傳遞[94-96]。擬南芥GAI的mRNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)頸環(huán)臂區(qū)域具有較強(qiáng)的移動(dòng)能力[97]。段續(xù)偉[87]鑒定了一個(gè)可以在杜梨韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞的mRNA分子，將其基因命名為PbWoxT1，該基因在韌皮部篩管伴胞中表達(dá)較強(qiáng)。在鴨梨/杜梨嫁接植株內(nèi)，PbWoxT1 mRNA能夠通過韌皮部進(jìn)行雙向傳遞。并且發(fā)現(xiàn)多聚嘧啶結(jié)合蛋白(PTB)PbPTB3在杜梨莖部伴胞中表達(dá)強(qiáng)烈，能夠促進(jìn)PbWoxT1在嫁接體系中傳遞量和傳遞率的增加。

嫁接還影響DNA的甲基化。嫁接可提高葫蘆砧西瓜嫁接苗幼苗期和開花期的全甲基化水平，但明顯降低了半甲基化水平。嫁接對(duì)西瓜接穗甲基化水平的影響大于對(duì)砧木的影響，對(duì)開花期DNA甲基化狀態(tài)改變的影響最大，嫁接導(dǎo)致的甲基化狀態(tài)改變方式主要為未甲基化與全甲基化狀態(tài)之間的改變[98]。毛常麗[99]用MSAP方法對(duì)3個(gè)橡膠樹品種IAN873、GT1、RRIM600嫁接前后砧木的甲基化水平分析表明，砧木嫁接后發(fā)生甲基化變化，模式變化主要以半甲基化與無甲基化間的相互轉(zhuǎn)換為主，而由半甲基化轉(zhuǎn)化為全甲基化或者由全甲基化轉(zhuǎn)換為半甲基化的很少，全甲基化與無甲基化間的轉(zhuǎn)換居中。但周貝貝[100]對(duì)不同嫁接組合核桃樹新梢韌皮部組織全基因組DNA甲基化分析未發(fā)現(xiàn)二者甲基化水平上有差異，而是改變了接穗DNA甲基化位點(diǎn)等遺傳信息，其中部分變化影響了參與光合作用和呼吸作用的相關(guān)基因，因此造成核桃生長(zhǎng)勢(shì)的差異。最新研究表明，DNA甲基化等表觀遺傳修飾可能是由于差異表達(dá)的small RNA調(diào)控了DNA甲基化模式的改變，從而改變了接穗基因表達(dá)活性，并且可以遺傳給后代。曹麗雯[85]對(duì)榨菜野生型與榨菜與紫甘藍(lán)嫁接嵌合體自交后代(GS1、GS3和GS5)進(jìn)行small RNA測(cè)序和MSAP分析發(fā)現(xiàn)，GS1群體發(fā)生了廣泛的DNA甲基化模式的變異，其中31.58%的DMFs(differentially methylated fragments)能至少穩(wěn)定遺傳5代，而剩余的68.42%的DMFs隨著連續(xù)自交可逐漸回復(fù)。嫁接誘導(dǎo)的DNA甲基化變異主要發(fā)生在轉(zhuǎn)座子和編碼基因的外顯子區(qū)域，其中包括提早開花基因和赤霉素調(diào)控基因；通過對(duì)DMFs的定量分析發(fā)現(xiàn)，嫁接誘導(dǎo)的DNA甲基化變異很可能會(huì)引起表型變異。將差異siRNAs與DMFs進(jìn)行匹配發(fā)現(xiàn)，嫁接導(dǎo)致siRNA的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，且部分差異表達(dá)的siRNA可能通過RdDM途徑調(diào)控CHH甲基化模式的改變，從而改變基因表達(dá)活性，并可遺傳給后代。基因表達(dá)水平在GSn中的變化規(guī)律也與嫁接誘導(dǎo)的變異表型的遺傳規(guī)律一致，即穩(wěn)定遺傳與回復(fù)同時(shí)存在。

5 展望

砧木與接穗的互作機(jī)理涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)方面，激素作為植物生理代謝的主要調(diào)控因子，其作用機(jī)理研究已取得很大進(jìn)展，但因植物種類的獨(dú)特性和多樣性，以及多種激素之間相互作用的復(fù)雜性，其在不同植物砧穗互作中的作用機(jī)理研究仍待深入。小RNA在砧穗互作中的作用已成為近年研究的熱點(diǎn)。lncRNA分子在成花調(diào)控方面的作用為互作機(jī)理研究提供了新思路。但有關(guān)小RNA分子的裝卸機(jī)制、可運(yùn)輸?shù)男NA分子序列特異性、小RNA分子是否必須和蛋白質(zhì)或其他分子結(jié)合、siRNA分子除通過RdDM途徑調(diào)控DNA甲基化模式外，是否可引發(fā)其他遺傳模式的改變需要深入研究，有可能成為將來的研究熱點(diǎn)。