李 勇，逄 濤*，鄭昀曄,，牛永志，師君麗，馬文廣,，盧秀萍

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021；2.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100)

【研究意義】種子質(zhì)量是種子潛力的綜合表現(xiàn)，種子具有優(yōu)良品質(zhì)是保證發(fā)芽快速及出苗整齊和健壯的先決條件[1]。高質(zhì)量種子具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力，對(duì)提高種子耐藏性和田間成苗率、抵抗苗期逆境、節(jié)省播種量、增加產(chǎn)量等具有重要意義[2-3]。種子質(zhì)量與種子成熟度直接相關(guān)，只有成熟度達(dá)到要求的種子才有可能具有高活力[4]。【前人研究進(jìn)展】目前，煙草種子成熟度主要依據(jù)蒴果和種子的顏色判斷，種子質(zhì)量主要依靠發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率判斷，在生化、分子方面的成熟機(jī)理研究尚未深入開展，煙草種子成熟度評(píng)價(jià)的內(nèi)在指標(biāo)缺乏[5]。煙草種子授粉后第27～33天采收的種子發(fā)芽率均可達(dá)90 %以上，但這期間不同采收時(shí)間的種子后期的活力和耐貯藏特性卻大不相同。因此，有必要在發(fā)芽率指標(biāo)的基礎(chǔ)上開發(fā)其他指標(biāo)(如種皮葉綠素?zé)晒鈁6])指示種子成熟度和質(zhì)量。蛋白質(zhì)在種子形成、發(fā)育到長(zhǎng)成幼苗的過(guò)程中均起著十分重要的作用[7]。蛋白質(zhì)組學(xué)是一種從整體水平上研究蛋白質(zhì)組成和調(diào)控規(guī)律的方法[8-9]。種子的蛋白組學(xué)分析是研究種子發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的重要手段，但目前煙草種子蛋白方面的研究只有蛋白提取檢測(cè)方法研究[10]和個(gè)別蛋白在煙草種子發(fā)育過(guò)程中變化規(guī)律研究[11]的報(bào)道，未見煙草種子發(fā)育蛋白組學(xué)研究的文獻(xiàn)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)為基礎(chǔ)，對(duì)煙草種子成熟過(guò)程蛋白組的變化開展研究，篩選煙草種子成熟過(guò)程中的關(guān)鍵差異蛋白。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為開發(fā)指示種子成熟度和質(zhì)量的分子標(biāo)記提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置、試劑及材料

色譜純甲醇購(gòu)買于德國(guó)Merck公司，實(shí)驗(yàn)用水由Millipore超純化系統(tǒng)制備。

AB SCIEX nanoLC-MS/MS(Triple TOF 5600 plus) (美國(guó)SCIEX公司)，配ChromXP C18分析柱(15 cm × 75 μm × 3 μm，美國(guó)SCIEX公司)，SB-50D超聲波提取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，MILLI-Q純水機(jī)(德國(guó)MILLIPORE公司)，Centrifuge 5804R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，CP2245分析天平(感量0.0001 g，德國(guó)Sartorious公司)，渦旋混勻器(荷蘭Breda公司)，CryoMill 磨樣機(jī)(德國(guó)Retsch公司)，CHRIST ALPHA 1-2/LD-Plus凍干機(jī)(德國(guó)Marin Christ 公司)。

使用的種子材料為烤煙品種云煙97。

1.2 蛋白提取及定量

取2 g煙草種子，液氮下磨成干粉(磨樣頻率30 Hz，磨樣時(shí)間30 s)，用200 μl的四乙基溴化銨裂解液(TEAB)溶解；超聲破碎15 min，離心(12 000 r/min)20 min取上清；加入4倍體積的冷丙酮(含10 mmol/L DTT，-20 ℃)沉淀2 h；離心(12 000 r/min)20 min，收集沉淀；加入800 μl的冷丙酮；離心(12 000 r/min)20 min，收集沉淀于室溫下放置5～10 min，自然揮發(fā)掉殘留溶劑后存于-80 ℃?zhèn)溆谩？偟鞍诐舛扔肂radford方法測(cè)定。

1.3 蛋白酶切、除鹽和標(biāo)記

取1 mg/mL蛋白溶液100 μl，加入50 mmol/L NH4HCO3500 μl，加入2 μg Tryspin酶液，37 ℃過(guò)夜；取上述酶解液，加入等體積的0.1 % 甲酸酸化酶解液；取出Strata-X C18柱用1 mL甲醇活化，加入1 mL 0.1 % 甲酸平衡；連續(xù)過(guò)3次將上述酸化后的酶解液加入到Strata-X C18柱子中；加入1 mL 清洗液(0.1 % 甲酸+5 %乙腈)，清洗2次；取1個(gè)新的離心管，往Strata-X C18柱子中加入1 mL洗脫液(0.1 %甲酸+80 %乙腈)洗脫1次，收集洗脫液；凍干后用20 μl 0.5 M TEAB復(fù)溶。蛋白標(biāo)記方法參考Itraq 8-plex reagent kit 說(shuō)明書。

1.4 色譜質(zhì)譜分析條件

色譜分析條件：色譜柱為ChromXP C18(15 cm × 75 μm × 3 μm)；A相為5 %乙腈水溶液添加0.1 %甲酸，B相為95 %乙腈水溶液添加0.1 %甲酸。線性梯度洗脫條件：0～65 min，B相由5 %上升至30 %，65～70 min，B相升至50 %，70～80 min，B相升至80 %，并維持5 min，85～85.1 min，B相降至5 %，并維持10 min；進(jìn)樣量，5 μl。

質(zhì)譜分析條件：采用正離子模式采集，采集范圍300～2200 m/z，采集頻率5 Hz。

1.5 蛋白質(zhì)鑒定和定量

使用ProteinpilotTMV4.5進(jìn)行蛋白鑒定并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行人工過(guò)濾，將置信度大于95 %且至少包含一個(gè)特征肽段的蛋白設(shè)為可信蛋白，不符合該條件的蛋白不予統(tǒng)計(jì)；對(duì)于鑒定的肽段，置信度大于95 %的被認(rèn)為是可信肽段，不符合該條件的肽段不予統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段種子萌發(fā)率

通過(guò)對(duì)授粉后不同階段的煙草種子進(jìn)行不同時(shí)間的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)(圖1)，發(fā)現(xiàn)授粉后第14天的種子完全不能萌發(fā)，授粉后第27和29天的種子在萌發(fā)14 d后基本達(dá)到成熟種子的萌發(fā)率，但相對(duì)成熟種子其萌發(fā)明顯滯后，而授粉后第31天的種子萌發(fā)率最高，是活力最高的成熟種子。

圖1 煙草種子在不同發(fā)育階段的萌發(fā)率

2.2 蛋白鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

授粉后第14、21、23、25、27、29、31、33天等8個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)種子樣品經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)到的所有二級(jí)譜圖數(shù)為269 818個(gè)，其中解析的二級(jí)譜圖數(shù)為83 852個(gè)，鑒定肽段數(shù)為14 316個(gè)，鑒定蛋白數(shù)為2852個(gè)。特征肽段統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，所鑒定的2852個(gè)蛋白中1973個(gè)蛋白至少包含2個(gè)特征肽段，占總蛋白數(shù)的69.18 %。對(duì)所鑒定的肽段進(jìn)行長(zhǎng)度分析，結(jié)果表明所鑒定的多肽平均長(zhǎng)度為13.48個(gè)氨基酸，處于肽段長(zhǎng)度合理范圍。蛋白鑒定覆蓋度分析表明，鑒定覆蓋度在0 %～10 %范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)所占比例為35.80 %，覆蓋度在10 %～20 %范圍內(nèi)的蛋白占25.53 %，覆蓋度大于20 %的蛋白占38.67 %，所有蛋白的平均覆蓋度為20.07 %，這組指標(biāo)與目前已報(bào)導(dǎo)的iTRAQ方法檢測(cè)蛋白質(zhì)組研究中蛋白覆蓋度相似[12-13]。對(duì)于一個(gè)鑒定到的蛋白質(zhì)，包含支持該蛋白的肽段越多，該蛋白的可信度就越高。實(shí)驗(yàn)中符合標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)鑒定覆蓋度表明鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。

2.3 差異蛋白篩選

以授粉后第14天的蛋白表達(dá)水平作為對(duì)照，分別對(duì)比第21、23、25、27、29、31、33天種子的差異表達(dá)蛋白，結(jié)果顯示在第21～27天隨著煙草種子發(fā)育差異表達(dá)蛋白數(shù)量逐漸增多，在第27～31天趨于穩(wěn)定，而第31～33天差異表達(dá)蛋白數(shù)量迅速回落(表1)。這一結(jié)果與上述煙草種子不同階段的萌發(fā)率十分吻合，說(shuō)明煙草種子成熟過(guò)程中，授粉后21～27 d可能是積累種子萌發(fā)所需結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的關(guān)鍵階段，種子萌發(fā)率穩(wěn)定上升，而27～31 d則可能是由功能蛋白調(diào)控代謝配置的階段，種子萌發(fā)率略有浮動(dòng)。進(jìn)一步對(duì)7組樣品間的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類分析，從蛋白表達(dá)聚類看，蛋白整體表達(dá)量隨種子成熟過(guò)程逐漸變化，從樣本聚類看，授粉后31 d與29、33、27 d均有較大差異(圖2)。

表1 不同發(fā)育階段煙草種子差異蛋白統(tǒng)計(jì)

行代表蛋白聚類，列代表樣品聚類。所有定量數(shù)據(jù)經(jīng)方差均一化處理

2.4 差異蛋白功能分析

為進(jìn)一步研究煙草種子發(fā)育過(guò)程不同階段蛋白功能的響應(yīng)，對(duì)每組樣品的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行相關(guān)基因功能注釋(gene ontology,GO)分析。結(jié)果顯示：授粉后第21和23天的差異表達(dá)蛋白顯著富集的功能都包括抗氧化活性、醛酮還原酶活性、結(jié)構(gòu)分子活性等；授粉后第25、27、29天，差異表達(dá)蛋白顯著富集的功能則出現(xiàn)了酶抑制劑活性、作用于NAD和NADP的氧化還原酶活性、肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、碳-碳水解酶活性等；授粉后第31、33天，差異表達(dá)蛋白顯著富集的功能又增加了核苷激酶、核苷酸激酶等活性。由此可知，種子發(fā)育過(guò)程中其蛋白功能發(fā)生階段性變化，早期主要是執(zhí)行種子形成的結(jié)構(gòu)功能，中期主要負(fù)責(zé)種子生命活動(dòng)的生化反應(yīng)，而后期主要維持遺傳物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡和穩(wěn)定。

2.5 種子成熟度標(biāo)記蛋白篩選

種子成熟度是種子品質(zhì)的重要保障，只有適熟種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和耐儲(chǔ)藏性等指標(biāo)才會(huì)最優(yōu)。而通過(guò)外觀判斷成熟度以指導(dǎo)采收常會(huì)出現(xiàn)主觀判斷失誤的情況，因此有必要在外觀判斷的基礎(chǔ)上開發(fā)成熟度相關(guān)分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)共篩選出4個(gè)相關(guān)差異蛋白，他們?cè)谶m熟期(授粉后第31天)之前表達(dá)量持續(xù)上升并在適熟期達(dá)到最高，隨后表達(dá)量急劇下降(圖3)。這些蛋白經(jīng)進(jìn)一步確認(rèn)后可以單獨(dú)或組合起來(lái)開發(fā)相關(guān)定量檢測(cè)試劑盒，作為指示種子成熟度和質(zhì)量的分子標(biāo)記。

圖3 煙草種子發(fā)育過(guò)程中相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到269 818個(gè)肽段二級(jí)質(zhì)譜圖，解析的二級(jí)譜圖數(shù)為83 852個(gè)，譜圖鑒定率為31.08 %，該鑒定率雖已達(dá)到同類研究的正常水平(如研究報(bào)導(dǎo)水稻種子應(yīng)用iTRAQ技術(shù)總共鑒定2711個(gè)蛋白[14]，芥藍(lán)種子應(yīng)用iTRAQ技術(shù)總共鑒定1532個(gè)蛋白[15])，但仍有69.92 %的譜圖信息未被解析。原因之一是種子樣品中蛋白含量差異很大，高豐度蛋白在檢測(cè)中會(huì)干擾低豐度蛋白的檢出，而低豐度蛋白通常二級(jí)質(zhì)譜圖信號(hào)較弱、譜圖不完整，因此無(wú)法很好的進(jìn)行譜圖匹配解析。其二是由于煙草種子蛋白組學(xué)研究較少，蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有完整的待解析肽段的標(biāo)準(zhǔn)譜圖記錄，因此部分肽段無(wú)法解析。譜圖鑒定率低是蛋白組學(xué)研究面臨的共性問(wèn)題，有待檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善。

4 結(jié) 論

通過(guò)蛋白組學(xué)分析表明，煙草種子在發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)蛋白的功能不同，前期表達(dá)的主要為種子形成結(jié)構(gòu)功能相關(guān)蛋白，中期主要為負(fù)責(zé)種子生命活動(dòng)的生化反應(yīng)相關(guān)蛋白，后期主要為維持遺傳物質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡和穩(wěn)定相關(guān)蛋白。研究篩選出6個(gè)相關(guān)蛋白，它們?cè)诜N子發(fā)育前期表達(dá)量不斷上升并在適熟時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最高，隨后表達(dá)量急劇下降。這些蛋白經(jīng)進(jìn)一步確認(rèn)后可作為指示種子成熟度和質(zhì)量的分子標(biāo)記。