任家慧，楊 淼，王 玥，黃 鈺，李 潤(rùn)，胡錦飆，肖關(guān)麗

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】馬鈴薯具有耐貧瘠、產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，是中國(guó)第四大糧食作物[1-2]。干旱是影響植物生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株死亡，造成不可逆?zhèn)3-4]。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)策略一直是抗旱生理的研究熱點(diǎn)。正常條件下，植物體內(nèi)的O2對(duì)植物沒(méi)有危害，而當(dāng)植物處于干旱條件下，O2可形成1O2，或逐步被還原成超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基[5-6]。超氧陰離子易通過(guò)自身歧化反應(yīng)或通過(guò)SOD催化生成H2O2，逆境脅迫下植物體內(nèi)大量積累H2O2，當(dāng)活性氧濃度超出防御機(jī)制所及范圍時(shí)，細(xì)胞將處于氧化脅迫狀態(tài)，對(duì)植物有機(jī)體極為有害[7]。馬鈴薯種植始終會(huì)遭受不同程度干旱的影響，影響馬鈴薯產(chǎn)量和塊莖質(zhì)量[8-9]。因此，研究馬鈴薯在干旱脅迫下抗氧化防御機(jī)制的響應(yīng)對(duì)馬鈴薯抗旱栽培及育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧平衡被打破，會(huì)通過(guò)酶促和非酶促抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)消除活性氧的傷害，干旱脅迫下植物體內(nèi)H2O2含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)或脅迫程度的增加而升高[10-11]，還原性抗壞血酸(AsA)，還原性谷胱甘肽(GSH)含量隨干旱脅迫程度增加，呈先升后降的變化趨勢(shì)，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性顯著高于對(duì)照，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)或脅迫程度的加劇先升后降，而單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)的變化在不同物種間有差異[12-14]。有關(guān)馬鈴薯對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)有不少研究報(bào)道，干旱脅迫會(huì)影響馬鈴薯的農(nóng)藝性狀、葉綠素含量、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、光合效率、葉綠素含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等酶活性變化，但針對(duì)馬鈴薯抗氧化防御系統(tǒng)尤其抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的系統(tǒng)研究報(bào)道較少[15-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)已經(jīng)成為植物抗旱生理評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，也是抗旱作物篩選的重要依據(jù)。云南冬春干旱頻發(fā)，云南主栽馬鈴薯品種抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)干旱脅迫響應(yīng)有必要進(jìn)行系統(tǒng)研究?！緮M解決關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用PEG-6000模擬不同程度干旱脅迫，研究其對(duì)馬鈴薯抗氧化防御系統(tǒng)中酶性及非酶性物質(zhì)的影響，為探明干旱脅迫對(duì)馬鈴薯抗氧化防御系統(tǒng)生理機(jī)制提供參考，為馬鈴薯抗旱栽培及育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種合作88號(hào)、青薯9號(hào)、麗薯6號(hào)、宣薯2號(hào)，種薯購(gòu)自于云南省尋甸六哨農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山大棚進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。選擇大小一致的馬鈴薯種薯播種，每個(gè)品種播種30盆，每盆2株。出苗后20 d進(jìn)行PEG模擬干旱脅迫處理，設(shè)PEG6000濃度為0 %(CK)、15 %、20 %、25 %、30 % 5個(gè)處理梯度。脅迫3 d后，取各品種馬鈴薯倒4葉、倒5葉進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，3次重復(fù)。

1.3 相關(guān)物質(zhì)及酶活性測(cè)定方法

對(duì)供試驗(yàn)樣品中類(lèi)胡蘿卜素(Car)、還原性抗壞血酸(AsA)、還原性谷胱甘肽(GSH)、可溶性蛋白(SP)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)進(jìn)行測(cè)定，所有指標(biāo)均采用蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯葉片過(guò)氧化氫及可溶性蛋白含量的影響

2.1.1 干旱脅迫下馬鈴薯葉片過(guò)氧化氫含量 從圖1可以看出，在PEG濃度為15 %～30 %的模擬干旱脅迫下，馬鈴薯葉片中H2O2含量隨著干旱程度的增加而增加，其中在PEG濃度 15 %輕度干旱脅迫下，合作88號(hào)、青薯9號(hào)、麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)葉片中H2O2含量均較對(duì)照明顯增加，其含量分別為(3.66±0.03)、(1.88±0.08)、(1.29±0.07)和(1.80±0.01)μmol/g，4個(gè)品種間差異顯著(F=6.59，P<0.05)。在PEG濃度 30 %的高度干旱脅迫下，葉片中H2O2含量達(dá)到最大，其中合作88號(hào)、青薯9號(hào)、麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)葉片中H2O2含量分別為(1.80±0.01) 、(2.84±0.01) 、(4.12±0.02) 和(5.23±0.01) μmol/g，4個(gè)品種間差異顯著(F=8.63，P<0.05)，與PEG濃度0 %(CK)相比，4個(gè)品種葉片中H2O2含量分別增加了719.57 %、333.90 %、425.44 %和79.60 %。綜合來(lái)看，PEG濃度15 %～30 %的干旱脅迫下馬鈴薯葉片H2O2含量，均表現(xiàn)為合作88號(hào)>青薯9號(hào)>宣薯2號(hào)>麗薯6號(hào)。在供試的4個(gè)品種中，合作88號(hào)過(guò)氧化氫(H2O2)積累量最大，氧化脅迫程度最高。

同一濃度數(shù)據(jù)上不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。下同

2.1.2 干旱脅迫下馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量 圖2結(jié)果表明，在PEG濃度15 %～30 %的模擬干旱脅迫下，馬鈴薯葉片可溶性蛋白的含量呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中PEG濃度15 %～25 %的干旱脅迫下，馬鈴薯葉片可溶性蛋白的含量隨著PEG濃度的上升而增加，在PEG濃度30 %時(shí)較PEG濃度 25 %時(shí)可溶性蛋白含量下降，供試合作88號(hào)、青薯9號(hào)、麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)葉片中可溶性蛋白含量分別為(0.07±0.01) 、(0.13±0.01) 、(0.06±0.01) 和(0.13±0.02) μmol/g，較PEG濃度25 %的干旱脅迫下上述4個(gè)品種馬鈴薯葉片可溶性蛋白的含量分別降低了63.16 %、27.78 %、83.78 %和27.78 %。由此表明，在較低PEG濃度的干旱脅迫下，馬鈴薯葉片中可溶性蛋白含量隨著干旱脅迫程度的增加而增加，但在較高PEG濃度的干旱脅迫下，馬鈴薯葉片中可溶性蛋白含量會(huì)急劇降低，對(duì)干旱脅迫的防御調(diào)控作用下降甚至喪失。

圖2 干旱脅迫條件下馬鈴薯葉片內(nèi)可溶性蛋白含量

2.2 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯葉片中抗氧化酶活性的影響

由圖3可以看出，在PEG濃度15 %、20 %、25 %和30 %處理下，4個(gè)馬鈴薯品種葉片中抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性隨著PEG 濃度的增加呈先增加后下降的變化趨勢(shì)，即在15 %～20 %濃度范圍內(nèi)，3種酶活隨PEG濃度的增加而增加，但當(dāng)PEG 濃度超過(guò)20 %后，這3種酶活即下降，當(dāng)PEG 濃度達(dá)30 %時(shí)，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)酶活降為最低，4個(gè)品種分別為 (55.16±11.17) 、(32.05±3.33) 、(71.77±3.56) 和(53.95±0.31) μmol/g，(171.46±3.08) 、(172.57±2.85) 、(131.86±3.10) 和(276.65±2.47) μmol/g。脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)于PEG 濃度達(dá)30 %時(shí)降為最低，4個(gè)品種分別為(484.74±13.69) 、(443.88±16.12) 、(438.73±6.67)和(545.25±2.75) μmol/g。單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)的酶活隨著PEG 濃度的增加呈先下降后增加的變化趨勢(shì)，即在15 %～20 %濃度范圍內(nèi)，2種酶的酶活隨PEG濃度的增加而降低，但當(dāng)PEG 濃度超過(guò)20 %后，這2種酶的酶活即增加，當(dāng)PEG濃度達(dá)25 %時(shí)，單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)酶活達(dá)最高，4個(gè)品種葉片的酶活分別為(477.86±8.93) 、(465.91±3.53) 、(348.11±8.47) 和(356.27±5.15) μmol/g。當(dāng)PEG濃度達(dá)20 %時(shí)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)酶活達(dá)最高，4個(gè)品種葉片的酶活分別為(16 730.02±140.00) 、(15 629.97±121.60) 、(16 494.97±135.10) 和(10 852.28±52.90) μmol/g。

圖3 干旱脅迫下馬鈴薯幼苗期葉片抗氧化酶活性變化

從不同濃度PEG干旱脅迫下各供試馬鈴薯品種葉片中各酶活峰值期來(lái)看，在脅迫后酶活峰值時(shí)合作88號(hào)葉片中抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性明顯高于其他品種(F=9.68，P<0.05)，宣薯2號(hào)葉片中脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)含量顯著高于合作88號(hào)(F=6.87，P<0.05)、麗薯6號(hào)(F=7.35，P<0.05)和青薯9號(hào)(F=8.32，P<0.05)。在脅迫后單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)峰值時(shí)，合作88號(hào)、青薯9號(hào)和麗薯6號(hào)品種葉片中單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)間無(wú)明顯差異(單脫氫抗壞血酸還原酶：F=7.43，P<0.05)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶F=8.29，P<0.05)。

2.3 干旱脅迫下馬鈴薯葉片中非酶性抗氧化物質(zhì)含量的變化

由表1表明，隨干旱脅迫程度的增強(qiáng)，馬鈴薯葉片中非酶性抗氧化物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)不盡相同，其中抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，而類(lèi)胡蘿卜素Car含量呈持續(xù)升高的變化趨勢(shì)。對(duì)于干旱脅迫下葉片中抗壞血酸的含量，在濃度25 % PEG的脅迫下，含量達(dá)峰值，合作88號(hào)、青薯9號(hào)、麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)葉片酶活分別為(0.21±0.01) 、(0.22±0.01) 、(0.97±0.01) 和(0.93±0.03) μmol/g，其中合作88號(hào)和青薯9號(hào)間無(wú)顯著差異(F=0.15，P>0.05)，麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)間無(wú)顯著差異(F=0.31，P>0.05)，但麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)葉片中抗壞血酸含量顯著高于合作88號(hào)(F=6.32，P<0.05)和青薯9號(hào)(F=7.43，P<0.05)。對(duì)于谷胱甘肽GSH含量，在PEG濃度25 %的脅迫下，谷胱甘肽GSH酶含量達(dá)峰值，4個(gè)品種葉片該酶含量分別為(1.78±0.01) 、(2.46±0.02) 、(1.78±0.01) 和(1.96±0.03) μmol/g；其中青薯9號(hào)葉片中谷胱甘肽GSH含量高于其他幾個(gè)品種，但差異不顯著(F=0.49，P>0.05)。對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素Car含量，在PEG濃度30 %的脅迫下，類(lèi)胡蘿卜素Car含量達(dá)峰值，4個(gè)品種葉片類(lèi)胡蘿卜素Car分別為(481.67±0.32) 、(485.21±2.18) 、(491.64±0.12) 和(490.41±0.20) μmol/g；其中青薯9號(hào)葉片中類(lèi)胡蘿卜素Car含量高于其他幾個(gè)品種，但差異不顯著(F=0.21，P>0.05)。

表1 干旱脅迫下馬鈴薯幼苗期葉片非酶性抗氧化物含量

3 討 論

3.1 干旱脅迫造成馬鈴薯葉片中過(guò)氧化氫含量上升

干旱是馬鈴薯生產(chǎn)中的主要限制因子，干旱脅迫下，植物體內(nèi)活性氧動(dòng)態(tài)平衡被破壞，大量活性氧和自由基積累。過(guò)氧化氫(H2O2)具有較強(qiáng)的氧化性，可直接氧化一些酶類(lèi)的疏基，使酶失去活性；還可與超氧陰離子反應(yīng)生成破壞性更強(qiáng)的單線(xiàn)態(tài)氧，對(duì)植物的生理活動(dòng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨PEG濃度的增加，馬鈴薯葉片內(nèi)過(guò)氧化氫含量呈逐漸上升趨勢(shì)，表明干旱脅迫下馬鈴薯受到氧化脅迫，且干旱程度越大，氧化脅迫程度越明顯，這與刑更生研究山黧豆幼苗中H2O2等含量的變化結(jié)果一致[18]。本研究還表明，不同馬鈴薯品種在干旱脅迫下受到的氧化脅迫程度有異，其中在干旱脅迫下合作88號(hào)馬鈴薯葉片內(nèi)過(guò)氧化氫積累量高于青薯9號(hào)、麗薯6號(hào)和宣薯2號(hào)，表明合作88號(hào)馬鈴薯品種對(duì)干旱脅迫具有較強(qiáng)的耐受性。

3.2 干旱脅迫下馬鈴薯葉片中的可溶性蛋白含量發(fā)生變化

植物在干旱脅迫下會(huì)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量以維持植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育，可溶性蛋白作為植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)可以維持植物與環(huán)境的滲透平衡[15,17]。干旱脅迫下，植物可溶性蛋白含量升高或降低均有研究報(bào)道[19-20]，本研究中可溶性蛋白含量隨干旱脅迫程度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，PEG濃度 25 %處理，馬鈴薯葉中可溶性蛋白含量最高，相比PEG濃度 0 %(CK)，麗薯6號(hào)變幅最大，合作88號(hào)變幅最小，這與陳浩維等研究玫瑰花瓣的結(jié)果一致[21]。說(shuō)明在干旱脅迫時(shí)，不同的馬鈴薯品種可通過(guò)增加葉片中可溶性蛋白的合成調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，以維持植物正常的生理活動(dòng)及生長(zhǎng)發(fā)育，但不同馬鈴薯品種間存在差異。

3.3 馬鈴薯葉片中非酶性抗氧化物質(zhì)對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生積極響應(yīng)

抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)、類(lèi)胡蘿卜素(Car)均為植物逆境條件下重要的非酶性抗氧化劑，對(duì)植物清除活性氧起到了至關(guān)重要的作用[22]。AsA在植物體內(nèi)共有4條合成途徑和一條再生途徑，其中再生途徑是植物體清除活性氧的主要途徑，不僅能夠作為APX的底物清除H2O2，還可作為抗氧化劑，歧化H2O2，還原超氧陰離子，猝滅單線(xiàn)態(tài)氧。本研究表明，隨干旱脅迫程度的增加，馬鈴薯葉片中AsA呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，但均明顯高于對(duì)照，這與鄭清嶺[23]等人報(bào)道的沙芥的研究結(jié)果相一致。GSH和AsA均為植物體內(nèi)高豐度小分子抗氧化物質(zhì)，能直接清除活性氧，也可通過(guò)AsA-GSH循環(huán)清除H2O2，本研究結(jié)果表明GSH的變化趨勢(shì)與AsA類(lèi)似。類(lèi)胡蘿卜素是氧化脅迫下，能保護(hù)葉綠體免受傷害的一類(lèi)非酶性抗氧化劑，本研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)胡蘿卜素含量在輕度干旱脅迫(PEG濃度15 %)時(shí)含量上升，中度干旱脅迫(PEG濃度20 %～25 %)含量略有下降但仍高于對(duì)照，重度干旱脅迫(PEG濃度30 %)含量上升。前人研究中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，植物體的類(lèi)胡蘿卜素含量變化趨勢(shì)不盡相同，含量升高、含量降低、先升高后降低、先降低后升高的結(jié)果均有報(bào)道[16,24]。Car變化趨勢(shì)不一致的原因可能是由于植物抵御干旱脅迫的能力不同，葉綠體損傷程度不同，從而導(dǎo)致Car變化不一致，物種和品種間差異較大。

3.4 干旱脅迫下馬鈴薯葉片中各抗氧化酶活性發(fā)生不同程度變化

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR))、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)是植物體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶，在干旱脅迫下，對(duì)植物清除H2O2具有重要作用[25-26]。APX和DHAR、MDHAR是AsA再生途徑的關(guān)鍵酶，APX以AsA為電子供體催化H2O2分解形成H2O和O2，減輕對(duì)植物的傷害，DHAR則利用GSH作為電子供體，將對(duì)植物有害的DHA還原為AsA，從而起到清除H2O2再生AsA的作用，MDHAR與DHAR和GSH共同協(xié)調(diào)作用維持植物體內(nèi)AsA水平[26]。GR作為重要的抗氧化酶類(lèi)，其主要作用是將氧化型谷胱甘肽還原為GSH，從而促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)，清除植物體內(nèi)過(guò)量的H2O2，降解氧化物起到對(duì)植物的保護(hù)作用。GPX在抗氧化防御系統(tǒng)中主要起到清除脂類(lèi)和烷基過(guò)氧化物的作用，也可與GSH協(xié)同清除H2O2。

有研究報(bào)道表明，隨干旱脅迫強(qiáng)度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，植物體內(nèi)對(duì)APX、MDHAR、DHAR、GPX、GR活性變化不同，如大豆、玫瑰、水稻等植物在中度干旱脅迫時(shí)APX、DHAR、GPX活性最強(qiáng)，MDHAR活性隨干旱脅迫程度增大而升高或無(wú)明顯變化[14,20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨干旱脅迫程度增加，4個(gè)馬鈴薯品種葉片中的APX、GR和DHAR均有不同程度的上升，而MDHAR在脅迫程度較低，即PEG濃度為15 %和20 %時(shí)，含量低于對(duì)照，之后隨脅迫程度上升，含量上升并顯著高于對(duì)照。究其原因，可能在輕度干旱脅迫時(shí)，APX、DHAR和GR即起到清除過(guò)氧化氫的作用，但對(duì)MDHAR有一定抑制作用，所以MDHAR含量低于對(duì)照，但重度干旱脅迫時(shí)，MDHAR參與到清除過(guò)氧化氫的過(guò)程中，所以含量上升。因此，各種酶類(lèi)在不同植物中的協(xié)同防御干旱的生理機(jī)制還值得進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

在干旱脅迫下，馬鈴薯通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)干旱脅迫及時(shí)作出響應(yīng)，其體內(nèi)各類(lèi)抗氧化酶及非酶性物質(zhì)相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，從而維持其正常生長(zhǎng)發(fā)育。隨干旱脅迫程度增加，馬鈴薯葉片中H2O2含量持續(xù)增加，抗氧化防御系統(tǒng)受激發(fā)，APX、GPX和DHAR的活性增加，馬鈴薯植株體內(nèi)AsA、GSH含量上升，協(xié)同緩解干旱所造成的傷害。中度干旱脅迫時(shí)馬鈴薯葉片中的抗氧化酶活性最強(qiáng)，AsA、GSH、Car和SP的含量最高，清除H2O2能力最強(qiáng)。此外，合作88號(hào)馬鈴薯在輕度和中度干旱下適應(yīng)性相對(duì)較強(qiáng)，較適合于干旱年份種植。