牛 霞， 張曉娟， 高迎真， 卞 琳， 張 玲

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，山西太原030001）

食管癌的發(fā)病率和死亡率分別居全球各種腫瘤類型的第8 位和第6 位［1］。在我國其組織學(xué)類型以鱗狀細胞癌（簡稱“鱗瘤”）為主，占90%以上，發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤的第3 位和第4 位［2-3］。食管鱗癌（esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC）早期的癥狀不明顯，亦無明確的診斷標(biāo)志物，確診時已處于中晚期，目前食管癌的治療方式以手術(shù)為主，但預(yù)后較差，5年生存率僅有15%～25%［4-5］。因此，研究食管鱗癌的發(fā)病機制，明確其早期診斷標(biāo)志物及治療靶點對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

越來越多的文獻報道，異常巖藻糖基化在腫瘤生物學(xué)的各個方面發(fā)揮著重要作用，例如腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移、血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫逃避等［6］。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等腫瘤中都存在異常巖藻糖基化，且異常巖藻糖基化可作為多種腫瘤的診斷標(biāo)志物［7］。巖藻糖基化是指將巖藻糖從GDP-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移到糖蛋白或糖脂中某些蛋白質(zhì)或N-和O-連接的聚糖等底物的過程。作為巖藻糖唯一供體的GDP-L-巖藻糖，其合成包括從頭合成和補救合成兩條途徑；其中，從頭合成途徑合成了人體內(nèi)90%的GDP-L-巖藻糖；該途徑的限速酶為 GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3，5 異構(gòu)酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxymannose-3，5-epimerase-4-reductase；又稱tissue specific transplantation antigen P35B，TSTA3）；該酶負責(zé)將GDP-D-甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖［8］。

本課題組前期對104 例食管鱗癌及其配對正常組織樣本進行了全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）和全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES），發(fā)現(xiàn)TSTA3基因存在2%的錯義突變頻率［9］，其定位于8q24.3，所在的區(qū)域存在顯著重復(fù)的拷貝數(shù)擴增［10］，說明TSTA3 與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是TSTA3 在食管鱗癌中的表達及其作用尚不明確。本研究通過一系列的體外實驗探索TSTA3 在食管鱗癌中的表達和生物學(xué)功能，并探究其對食管鱗癌巖藻糖基化修飾的影響。

材 料 和 方 法

1 臨床標(biāo)本

45 例ESCC 患者手術(shù)切除的食管鱗癌組織和距離腫瘤至少5 cm以上的配對癌旁組織收集于山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，石蠟包埋組織，并選擇合適組織制備組織芯片作為研究對象。此研究通過山西醫(yī)科大學(xué)及山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審核。所有病例包括:男性33 例，女性12 例；年齡≥60 歲的有 27 例，＜60 歲的有 18 例；TNM 分期 I～II 患者 23 例，III～IV 患者 22 例；有淋巴轉(zhuǎn)移患者 22 例（N1 有 13 例，N2 有 5 例，N3 有 4 例），無淋巴轉(zhuǎn)移（N0）患者23例。術(shù)前均未進行放、化療等治療。

2 細胞

本實驗所用的人食管鱗癌細胞系KYSE180、KYSE450、KYSE150、KYSE410、KYSE510、ECA109和TE-1 均由山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心食管癌發(fā)病機理及轉(zhuǎn)化研究中心重點實驗室保存。

3 主要試劑和儀器

兔抗人TSTA3 多克隆抗體購自Abcam；鼠抗人β-actin 多克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；熒光素（fluorescein）標(biāo)記的扁豆凝集素（Lens culinarisagglutinin，LCA）購 自 Vector Laboratories；RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自HyClone；MTT 和二甲基亞砜購自Sigma；TSTA3 過表達慢病毒LV13-Homa TSTA3（NM_003313）和陰性對照慢病毒LV13 negative control（LV13 NC）購自吉瑪基因。光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus；自動酶標(biāo)儀購自BioTek。

4 主要方法

4.1 免疫組化實驗 取石蠟切片常規(guī)脫蠟；行抗原修復(fù)；PBST 洗脫3 次；4℃孵育I 抗過夜；室溫復(fù)溫1 h，PBST 洗脫3 次；37℃孵育 II 抗 20 min；PBST 洗脫4 次后進行DAB 顯色；蘇木素復(fù)染；用梯度乙醇及二甲苯進行脫水；中性樹脂進行封片；通過ScanScope?AT 病理掃描系統(tǒng)（Aperio）進行免疫組化切片掃描，并利用ImageScope 圖像分析軟件（Aperio）分析組織樣本中TSTA3 蛋白表達情況，根據(jù)染色深淺自動計算出組織化學(xué)評分（histochemistry score，H-score），即代表TSTA3蛋白表達水平。

4.2 細胞培養(yǎng) 人食管鱗癌細胞系KYSE180、KYSE450、KYSE150、KYSE410、KYSE510、ECA109和TE-1 均采用含10% FBS 的RMPI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃、100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)液，當(dāng)細胞長至80%～90%融合度時進行傳代。

4.3 慢病毒感染 提前1 d 在96 孔板中接種KYSE150 細胞和 KYSE450 細胞；待第 2 天融合度達50%～70%時，加入已經(jīng)稀釋好的不同MOI 梯度的慢病毒稀釋液；12～24 h 后，移去感染細胞的病毒液體，加入0.2 mL 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；根據(jù)細胞狀態(tài)及融合度，將細胞消化轉(zhuǎn)移到24 孔板，加入嘌呤霉素，篩選穩(wěn)定過表達TSTA3 的KYSE150 和KYSE450細胞系，命名為TSTA3 over-expression（TSTA3-OE），感染陰性對照病毒LV13 NC 的細胞為NC 組。利用qPCR和Western blot檢測過表達效率。

4.4 qPCR 實驗 收集新鮮的細胞沉淀，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參照，采用qPCR 法檢測 TSTA3 的 mRNA 表達量。用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。反應(yīng)體系為:TB Green Premix Ex Taq 12.5 μL，三蒸水10.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL。根據(jù)GeneBank 中相應(yīng)基因序列及Primer Premier 5 軟件設(shè)計特異性擴增引物。GAPDH 的上游引物序列為5'-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3'，下游引物序列為5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'；TSTA3 的上游引物序列為5'-CGTCATCCATCTTGCTGCAA-3'，下游引物序列為5'-AGGTCGTCTTGTCAGGGAAG-3'。

4.5 Western blot實驗 收取新鮮的細胞沉淀，提取總蛋白；BCA 法測蛋白濃度；蛋白變性及制備蛋白樣品；SDS-PAGE 分離2～3 h；利用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h；4℃孵育兔抗人TSTA3 抗體（1∶500）及鼠抗人β-actin 抗體（1∶2 000）過夜；TBST 洗膜3次，室溫孵育HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶2 000）2 h；TBST洗膜4次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

4.6 MTT 實驗 每組細胞消化后以每孔3 000 個接種于96 孔板，每孔培養(yǎng)液的最終體積為200 μL，分別在培養(yǎng) 24、48、72 和 96 h 后每孔加入 20 μL MTT（5 g/L）溶液；培養(yǎng)箱中放置4 h 后吸去培養(yǎng)液，加入200 μL 二甲基亞砜，室溫搖床孵育15 min，采用酶標(biāo)儀直接檢測每孔的吸光度（A）；根據(jù)每組細胞的A值繪制折線圖，比較每組細胞的活力。

4.7 集落形成實驗 消化各組細胞，每孔接種500個細胞于6 孔板中，加入2 mL 含10% FBS 的完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)7～14 d 后，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min；顯微鏡下觀察并計數(shù)有效集落數(shù)（≥50個細胞的團塊結(jié)構(gòu)為1個集落）。

4.8 Transwell 實驗 細胞侵襲實驗:在Transwell 小室中加入100 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的Matrigel（BD）；消化各組細胞，小室中加入5×104個細胞，上室加入200 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，下室加入 600 μL 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min，觀察穿過小室底部膜的細胞，拍照并計數(shù)。細胞遷移實驗與上述侵襲實驗操作流程大致相同，只是去掉其中的Matrigel處理和預(yù)鋪設(shè)。

4.9 流式細胞術(shù)檢測LCA 消化各組細胞，PBS 清洗細胞沉淀；加入不同濃度的fluorescein 標(biāo)記的LCA，室溫避光孵育1 h；離心，1%多聚甲醛重懸細胞沉淀，固定20 min；上機檢測各組細胞的熒光強度。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用Student'st檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TSTA3在食管鱗癌組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，TSTA3主要在胞漿中表達，其在癌旁組織和食管鱗癌組織中的表達量分別為13.08±18.74 和52.21±40.26，TSTA3 在食管鱗癌組織中的表達顯著高于癌旁組織（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The expression of TSTA3 in ESCC tissues（immunohistochemical staining，×200）.Mean±SD. n=45.**P＜0.01 vs adjacent group.圖1 TSTA3在食管鱗癌組織中的表達情況

2 過表達 TSTA3 的 KYSE150 和 KYSE450 細胞構(gòu)建成功

利用qPCR 檢測 KYSE180、KYSE450、KYSE150、KYSE510、KYSE410、ECA109 和 TE-1 細胞中 TSTA3的mRNA 表達情況，并選擇TSTA3 內(nèi)源性低表達的KYSE150 細胞和 KYSE450 細胞感染 TSTA3 過表達慢病毒，通過qPCR 和Western blot 檢測過表達效率，結(jié)果顯示，與相應(yīng)的陰性對照組相比，KYSE150 細胞和KYSE450 細胞感染慢病毒后，TSTA3 的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.TSTA3 was successfully over-expressed in KYSE150 and KYSE450 cells.A:the mRNA levels of TSTA3 in ESCC cell lines；B，C:qPCR and Western blot were used to detect the over-expression efficiency of TSTA3 in KYSE150 and KYSE450 cells after infection with lentivirus.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs KYSE150 NC group；##P＜0.01 vs KYSE450 NC group.圖2 KYSE150和KYSE450細胞中TSTA3過表達成功

3 TSTA3對食管鱗癌細胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，TSTA3過表達后 24、36、48、72 和 96 h，KYSE150 和 KYSE450 細胞活力的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖3A；集落形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，KYSE150 和 KYSE450 細胞過表達 TSTA3 后集落形成能力的差異亦無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖3B。這表明TSTA3 不影響食管鱗癌細胞的增殖能力。

4 TSTA3對食管鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 實驗結(jié)果顯示，KYSE150 細胞 NC 組和TSTA3-OE 組的遷移細胞數(shù)分別為87±10 和203±16，侵襲細胞數(shù)分別為 60±27 和180±17；KYSE450 細胞NC 組和TSTA3-OE 組的遷移細胞數(shù)分別為37±5和89±3，侵襲細胞數(shù)分別為37±7 和79±6；2 種細胞TSTA3-OE 組遷移和侵襲細胞數(shù)與相應(yīng)的NC 組相比均顯著增多（P＜0.01），見圖4。這提示TSTA3 過表達可促進食管鱗癌細胞的遷移和侵襲。

5 TSTA3 對食管鱗癌細胞核心巖藻糖基化水平的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，KYSE150 細胞NC 組和TSTA3-OE組的熒光強度分別為 96.00±4.55 和121.03±7.01；KYSE450 細胞 NC 組和 TSTA3-OE 組的熒光強度分別為66.71±3.58 和93.62±3.34；2 種細胞TSTA3-OE組熒光強度與相應(yīng)的NC組相比均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5。這提示在食管鱗癌細胞中過表達TSTA3可以提高細胞核心巖藻糖基化修飾水平。

Figure 3.The effects of TSTA3 over-expression on the viability（A）and colony formation ability（B）of ESCC cells.Mean±SD. n=5.圖3 TSTA3過表達對ESCC細胞活力和集落形成能力的影響

Figure 4.The effects of TSTA3 over-expression on the migration and invasion abilities of ESCC cells were detected by Transwell assays（×100）.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs KYSE150 NC group；##P＜0.01 vs KYSE450 NC group.圖4 TSTA3過表達對ESCC細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 5.The effect of TSTA3 over-expression on core fucosylation modification of ESCC cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs KYSE150 NC group；##P＜0.01 vs KYSE450 NC group.圖5 TSTA3過表達對ESCC細胞系核心巖藻糖基化修飾的影響

討 論

蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)功能性修飾，在細胞黏附、受體激活、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)等多種細胞過程中發(fā)揮重要作用［11-14］。巖藻糖基化是糖基化的修飾方式之一，在ABO血型抗原、宿主-微生物間的相互作用、選擇素介導(dǎo)的白細胞外滲、淋巴細胞歸巢等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，其中GDP-L-巖藻糖是巖藻糖基化的重要中間產(chǎn)物，是巖藻糖基化的唯一供體。TSTA3是GDP-L-巖藻糖從頭合成途徑的限速酶［15］。

基于本課題組前期食管鱗癌組織及配對正常組織的組學(xué)測序，我們發(fā)現(xiàn)巖藻糖/甘露糖代謝通路在I期病例中的突變頻率顯著高于III 期，TSTA3基因編碼該通路的限速酶，且TSTA3基因所在的區(qū)域存在顯著且重復(fù)的拷貝數(shù)擴增，說明TSTA3 與食管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-17］。

在結(jié)直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤中均存在TSTA3 的表達增高。在結(jié)直腸癌，干擾TSTA3表達可導(dǎo)致選擇素配體——唾液酸化Lewis a 抗原的表達下調(diào)，降低了細胞對活化人臍靜脈內(nèi)皮細胞和E-選擇素的黏附能力，并降低對細胞外基質(zhì)和纖連蛋白的黏附，與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)［18］；在乳腺癌，腫瘤組織中TSTA3 的表達與乳腺癌患者的TNM 分期相關(guān)，且TSTA3高表達的患者預(yù)后較差，是一個獨立的預(yù)后因素，并且在乳腺癌細胞中敲除TSTA3可引起CXCR4、CXCL12、MMP9等基因的表達下調(diào)，說明TSTA3與腫瘤細胞的侵襲能力相關(guān)［19］。

本研究中，免疫組化結(jié)果顯示，TSTA3 在ESCC組織中顯著高表達，且過表達TSTA3 可以明顯促進ESCC 細胞的侵襲和遷移能力，提示TSTA3基因在ESCC 中發(fā)揮癌基因作用。LCA 屬于豆科凝集素家族，是一種核心巖藻糖結(jié)合凝集素，可特異性結(jié)合核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)，長期以來被用作特異性探針［20］。我們利用LCA 作為特異性探針，發(fā)現(xiàn)TSTA3過表達可以提高ESCC 細胞核心巖藻糖基化修飾水平，提示TSTA3 參與調(diào)節(jié)ESCC 核心巖藻糖基化修飾。

在肝細胞癌和非小細胞肺癌，TSTA3 誘導(dǎo)的GDP-L-巖藻糖和核心巖藻糖基化水平升高，說明TSTA3 可能作為腫瘤的潛在診斷標(biāo)志物［21-22］；另外，6-炔基-巖藻糖（6-alkynyl-fucose，6-Alk-Fuc）是一種巖藻糖基化探針，也是巖藻糖基化抑制劑，通過阻斷FX 酶（由TSTA3基因編碼）介導(dǎo)的巖藻糖基化，消耗GDP-巖藻糖，抑制巖藻糖基化，從而抑制肝癌細胞的侵襲和遷移，但對增殖沒有影響［23］。因此，TSTA3可能通過調(diào)節(jié)巖藻糖基化修飾在ESCC 中發(fā)揮促進腫瘤細胞侵襲和遷移的作用。本研究為靶向TSTA3藥物和巖藻糖基化抑制劑在ESCC 治療中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。