賀素容 杜遠東王 晶張景霞吳 博吳建華王昌利趙重博*

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西咸陽 712046； 2.陜西省中藥飲片工程技術(shù)研究中心，陜西咸陽 712046；3.漢中市食品藥品檢驗檢測中心，陜西漢中 723000）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其性寒，味苦，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)［1-2］，功效清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎，常用于治療濕溫、暑濕、胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動不安。其主要成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、心血管保護、鎮(zhèn)痛、保肝等藥理作用［3-6］。

2015 年版《中國藥典》 中黃芩飲片類型有生黃芩、酒黃芩2 種，該藥材酒炙后入血分，可借黃酒升騰之力上行，用于上焦肺熱及四肢肌表之濕熱，同時酒性大熱，可緩和苦寒之性。因此，黃芩炮制品也有很好的臨床療效，并且不同酒炙工藝會產(chǎn)生質(zhì)量差異，從而影響其效果。

一直以來，中藥炮制技術(shù)就有著機制不明確、工藝粗糙等問題，同時炮制過程也會受很多主觀因素的影響，導致難以把控飲片質(zhì)量［7-10］。本實驗將優(yōu)化黃芩酒炙工藝，考察主要指標成分含有量的變化，并建立大鼠炎癥模型來探索酒炙對該藥材藥效的影響，以期為其炮制工藝建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

FA2004N 型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；KH-400-KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Waters 高效液相色譜儀（配置Waters-2695 檢測器、Empower Pro 化學工作站）；0.22 μm 微孔濾膜［杉羽（天津） 科技發(fā)展有限公司］；DT8380 型紅外測溫儀（深圳查爾孟科技有限公司）；198 型中藥參茸切藥機（兆申興盛有限公司）；WK-800A 型高速藥物粉碎機（青州市精誠機械有限公司）；101 型電熱鼓風干燥機（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；PV-200型足腫脹測定儀（成都泰盟科技有限公司）。

黃芩購于陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學王昌利教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。黃芩苷（批號110715-201720）、漢黃芩苷（批號B20488）、黃芩素 （批號110595-201607）、漢黃芩素 （批號111514-201605） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。市售紹興黃酒（乙醇14.5%）。乙腈、甲醇為色譜純；95%乙醇、甲醇、磷酸為分析純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒黃芩制備 參考文獻［9］報道結(jié)合實際操作，初步擬定制備方法為稱取黃芩50 g，加15%黃酒拌勻后悶潤20 min，在120 ℃投藥溫度下炒炙10 min，取出，晾涼，即得。

2.2 各成分含有量測定

2.2.1 色譜條件 Ultimate? XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脫（0～15 min，15%～25%乙腈；15～31 min，25%～55%乙腈；31～40 min，55%～65%乙腈）；體積流量1 mL／min；檢測波長275 nm；進樣量30 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素對照品各20 mg，黃芩苷對照品40 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，得到貯備液，各吸取1 mL 至25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素質(zhì)量濃度均為0.050 mg／mL，黃芩苷質(zhì)量濃度為0.100 mg／mL）。

2.2.3 供試品溶液制備 取酒黃芩粉末約0.3 g，精密稱定，加入70% 乙醇40 mL，加熱回流提取3 h，放冷，濾過，濾液置于100 mL 量瓶中，少量70%乙醇多次洗滌容器和殘渣，洗液合并到同一量瓶中，70%乙醇定容至刻度，搖勻，精密移取1 mL于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取 “2.2.2”項下貯備液，甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.016 7、0.012 5、0.001 mg／mL，黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素質(zhì)量濃度均為0.050 0、0.025 0、0.012 5、0.008 3、0.006 3、0.005 0 mg／mL 的溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣30 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程分別為黃芩苷Y＝27 100X＋6 689 （R2＝0.999 5）、漢黃芩苷Y＝61 658X＋19 078 （R2＝0.999 4）、黃芩素Y＝25 979X＋8 832 （R2＝0.999 4）、漢黃芩素Y＝47 785X＋8 658 （R2＝0.999 7），分別在1.000 0～100.000 0、5.000 0～50.000 0、5.000 0～ 50.000 0、5.000 0～50.000 0 μg／mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，每次30 μL，測得黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素峰面積RSD 分別為1.02%、0.73%、0.39%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取酒黃芩粉末適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素峰面積RSD 分別為0.83%、1.11%、0.98%、1.01%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定2 次，每次30 μL，測得黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素峰面積RSD 分別為1.07%、0.21%、0.48%、0.98%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素質(zhì)量濃度已知（0.103、0.125、0.087、0.054 mg／mL） 的酒黃芩粉末6份，每份0.30 g，置于同一10 mL 量瓶中，加入“2.2.2”項下對照品溶液1.5 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素平均加樣回收率分別為102.3%、99.7%、101.5%、98.9%，RSD 分別為1.70%、2.21%、1.48%、3.46%。

2.3 醇溶性浸出物含有量測定 參照2015 年版《中國藥典》 一部［11］醇溶性浸出物測定法（通則2201） 項下的熱浸法進行測定，以稀乙醇為溶劑。

2.4 單因素試驗 在2015 年版《中國藥典》 酒黃芩質(zhì)量標準中，僅有黃芩苷含有量測定，故本實驗以其為評價指標。

2.4.1 加酒量 稱取黃芩飲片5 份，每份50 g，加5%、10%、15%、20%、25% 黃酒拌勻后悶潤20 min，置于容器中，在120 ℃投藥溫度下炒炙10 min，取出，晾涼（加20%、25%黃酒時不能完全吸干），測定黃芩苷含有量，結(jié)果見圖2。由此可知，黃芩苷含有量隨著加酒量增加而升高，但超過10%后其升高程度趨緩，故確定加酒量為10%。

2.4.2 悶潤時間 稱取黃芩飲片5 份，每份50 g，加10%黃酒拌勻后悶潤10、20、30、40、50 min，置于容器中，在120 ℃投藥溫度下炒炙10 min，取出，晾涼（悶潤10 min 時切開斷面未潤透），測定黃芩苷含有量，結(jié)果見圖2。由此可知，悶潤30 min時黃芩苷含有量最高，但繼續(xù)延長后其變化不明顯，故確定悶潤時間為30 min。

2.4.3 投藥溫度 稱取黃芩飲片5 份，每份50 g，加10%黃酒拌勻后悶潤30 min，置于容器中，在80、100、120、140、160 ℃下炒炙10 min，取出，晾涼，測定黃芩苷含有量，結(jié)果見圖2。由此可知，投藥溫度120 ℃時黃芩苷含有量最高，但繼續(xù)提高后其反而降低，故確定投藥溫度為120 ℃。

2.4.4 炒炙時間 稱取黃芩飲片5 份，每份50 g，加10%黃酒拌勻后悶潤30 min，置于容器中，在120 ℃投藥溫度下炒炙5、10、15、20、25 min，取出，晾涼（炒炙5 min 時黃芩未完全炒干），測定黃芩苷含有量，結(jié)果見圖2。由此可知，炒炙15 min時黃芩苷含有量最高，但繼續(xù)延長后其反而降低，故確定炒炙時間為15 min。

2.5 Plackett-Burman 設計 在單因素試驗基礎上，通過Design-Expert 10.0 軟件進行Plackett-Burman設計［12-14］，選擇加酒量（A）、悶潤時間（B）、投藥溫度（C）、炒炙時間（D） 作為影響因素，設置2 個水平（-1、1）；黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、醇溶性浸出物含有量作為評價指標，Hassan 法［15］測定其“歸一值”（d），再計算總評“歸一值”（OD），公式為OD＝ （d1d2…dk）1／k，其中k為指標數(shù)，因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。由此可知，各因素影響程度依次為炒炙時間（D） ＞加酒量（A） ＞投藥溫度（C） ＞悶潤時間（B），其中前3 個因素有顯著影響（P＜0.05），而因素B影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)合單因素試驗，確定悶潤時間為30 min。

圖2 各因素對黃芩苷含有量的影響Fig.2 Effects of various factors on baicalin content

表1 Plackett-Burman 設計因素水平Tab.1 Factors and levels for Plackett-Burman design

2.6 Box-Behnken 響應面法 根據(jù)單因素試驗、Plackett-Burman 設計結(jié)果，選擇加酒量（A）、投藥溫度（C）、炒炙時間（D） 作為影響因素，設置3 個水平（-1、0、1）；黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、醇溶性浸出物含有量作為評價指標，按“2.5”項下方法計算OD值，因素水平見表4，結(jié)果見表5。

通過Design-Expert 10.0 軟件將表5 數(shù)據(jù)進行二項式擬合，得到方程為OD＝0.69 ＋0.068A-0.082C＋0.10D-0.16AC＋0.070AD＋8.028×10-3CD-0.12A2-0.41C2-0.073D2（R2＝0.994 9），方差分析見表6，可知模型擬合情況良好（P＜0.01），可用于預測。響應面分析見圖3。

由此得到，最優(yōu)工藝為加酒量9.693%，悶潤時間30 min，投藥溫度127.217 ℃，炒炙時間17.217 min 時，結(jié)合實際情況，將其修正為加酒量10%，悶潤時間30 min，投藥溫度127 ℃，炒炙時間17 min，OD值0.78。按照上述優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗，結(jié)果見表7，可知工藝穩(wěn)定可行，適合實際需求。

表2 Plackett-Burman 設計方案與結(jié)果Tab.2 Schemes and results of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 設計方差分析Tab.3 Analysis of variance for Plackett-Burman design

表4 Box-Behnken 響應面法因素水平Tab.4 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表5 Box-Behnken 響應面法方案和結(jié)果Tab.5 Schemes and results of Box-Behnken response surface method

表6 Box-Behnken 響應面法方差分析Tab.6 Analysis of variance for Box-Behnken response surface method

2.7 抗炎活性研究 30 只SD 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為模型組、生品組、酒炙品組，每組10只。稱定質(zhì)量后，模型組大鼠灌胃給予生理鹽水（10 mL／kg），其他2 組大鼠灌胃給予相應提取物混懸液（6 g／kg，按生藥量算）［16］，每天1 次，連續(xù)8 d。最后1 次灌胃結(jié)束1 h 后，各組大鼠右足趾部皮下注射1%角叉菜膠溶液0.1 mL 致炎，標記右足測量部位，于致炎前及致炎后1、2、3、4、5 h采用足腫脹測定儀測定右足厚度，參考文獻［17］報道的方法計算足腫脹度，公式為足腫脹度＝致炎后足厚度-致炎前足厚度。通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，結(jié)果見表8。

3 討論

黃芩是典型的清熱燥濕藥，中醫(yī)認為其藥性苦寒而能燥濕泄熱，但易傷及人體正氣，故臨床上大多用黃酒炮制，既以黃酒熱性緩和黃芩苦寒之性，又利用黃酒易入血分的特點增強黃芩清熱作用?，F(xiàn)代研究更注重炮制過程中化學成分的變化，黃芩苷具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，易隨溫度升高而加速氧化降解進程，是黃芩發(fā)揮抗炎活性的關鍵物質(zhì)基礎，其含有量隨著炒制時間延長呈先升后降的趨勢，與熊優(yōu)等［7］報道一致，而且炒炙時間是黃芩酒炙過程中最主要的影響因素。

圖3 各因素響應面圖Fig.3 Response surface plots for various factors

表7 驗證試驗結(jié)果（n＝3）Tab.7 Results of verification tests （n＝3）

本實驗采用Plackett-Burman 設計結(jié)合Box-Behnken響應面法優(yōu)化黃芩酒炙工藝，相比于正交實驗，上述方法可連續(xù)地對各水平進行分析，而且結(jié)果更直觀準確［18］。再考察了檢測波長 （275、280 nm）、流動相系統(tǒng)（乙腈-0.1%磷酸等度洗脫、梯度洗脫）、進樣量（10、20、30 μL）［19］，發(fā)現(xiàn)在275 nm 波長下進樣30 μL，以乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫時，色譜峰基線平穩(wěn)，各成分峰面積高，分離度良好。

表8 3 組大鼠足腫脹度（mL，， n＝10）Tab.8 Paw swelling degrees of rats in three groups （mL，， n＝10）

表8 3 組大鼠足腫脹度（mL，， n＝10）Tab.8 Paw swelling degrees of rats in three groups （mL，， n＝10）

注：與模型組比較，＃P＜0.05；與生品組比較，▲P＜0.05。

角叉菜膠致大鼠足腫脹實驗結(jié)果表明，黃芩具有較好的抗炎活性，經(jīng)酒炙后可進一步增強，符合黃芩酒炙增效這一傳統(tǒng)觀點。有研究表明，黃芩的抗炎活性是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等多成分共同作用的結(jié)果［20］，可能與優(yōu)化工藝中酒炙黃芩所含上述成分含有量較高有關，具體有待進一步研究。