劉加元，張建超

（1.湖北省第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430033； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065）

保兒寧顆粒是由炙黃芪、防風(fēng)、茯苓、炒白術(shù)、蘆根、雞內(nèi)金、炒山藥7 味藥材加工而成的兒科用中成藥，具有益氣固表、健中醒脾之功效，用于脾肺氣虛所致的神倦納呆、面黃肌瘦、煩燥不寧、表虛自汗、易感風(fēng)邪等病癥的治療［1］。研究表明，它能顯著延長(zhǎng)小鼠缺氧情況下的存活時(shí)間，增加小鼠體體質(zhì)量和食欲［2］；對(duì)小兒反復(fù)呼吸道感染療效顯著［3］，可增加呼吸道免疫功能［4］，對(duì)哮喘合并反復(fù)呼吸道感染引起免疫功能紊亂的療效明顯［5］，有效改善變應(yīng)性鼻炎合并哮喘患兒免疫功能，減少呼吸道感染發(fā)生，減輕變應(yīng)性鼻炎和哮喘的臨床癥狀［6］；聯(lián)合布地奈德、孟魯司特時(shí)，治療小兒變應(yīng)性鼻炎臨床效果理想［7-12］，而聯(lián)合利巴韋林、阿昔洛韋時(shí)，能明顯提高反復(fù)呼吸道感染患兒身體抵抗力［13］。

保兒寧顆粒收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 （中藥成方制劑第十五冊(cè)）［1］，但未對(duì)方中成分進(jìn)行定量分析，前期文獻(xiàn)也僅涉及其所含的黃芪甲苷、升麻素苷［14-15］。中藥及其復(fù)方制劑成分復(fù)雜，單一成分難以全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量，多組分質(zhì)量控制模式已逐漸應(yīng)用于相關(guān)檢測(cè)中。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法對(duì)保兒寧顆粒中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含有量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，以期為該制劑多指標(biāo)成分控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考依據(jù)。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；AB135-S 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)111920-201606，純度97.6%）、升麻素苷（批號(hào)111522-201712，純度96.2%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)111523-201811，純度97.4%） 對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；亥茅酚苷（批號(hào)15012605，純度96.9%）、去氫茯苓酸（批號(hào)14032101，純度 99.4%）、茯苓酸 （批號(hào)15030404，純度98.6%） 對(duì)照品均購(gòu)于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；芒柄花苷（批號(hào)17081841，純度98.2%）、芒柄花素（批號(hào)16122221，純度99.0%）、升麻素（批號(hào)18042043，純度99.8%）、去氫土莫酸（批號(hào)17091513，純度98.2%） 對(duì)照品均購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；缺炙黃芪、缺防風(fēng)、缺茯苓、缺炒白術(shù)、缺蘆根、缺雞內(nèi)金、缺炒山藥陰性樣品均購(gòu)于武漢市神草中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張建超副教授鑒定為正品，按相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定。保兒寧顆粒（每袋裝10 g，批號(hào)20180709、20181002、20190304） 購(gòu)于貴州百靈企業(yè)集團(tuán)正鑫藥業(yè)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Extend XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相［乙腈-甲醇（9∶1）］（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～13.0 min，35.0% A；13.0～34.0 min，35.0%～44.0%A；34.0～55.0 min，44.0%～70.0%A；55.0～69.0 min，70.0%～92.0% A；69.0～75.0 min，92.0%～35.0% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm （0～55.0 min，毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷）［16-18］、210 nm （55.0～75.0 min，去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸）［19-20］；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇溶解稀釋成分別含毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸1.116、0.784、1.468、3.592、1.024、1.956、0.832、0.356、0.264、0.428 mg／mL的貯備液，各精密量取2.5 mL，置于同一100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（各成分含有量分別為27.9、19.6、36.7、89.8、25.6、48.9、20.8、8.9、6.6、10.7 μg／mL）。

2.3 供試品溶液 取顆粒適量，研細(xì)，取粉末約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲 （200 W、40 kHz）提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝，分別制備缺炙黃芪、缺防風(fēng)、缺茯苓的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均低于4 000，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 個(gè)25 mL 量瓶中，甲醇依次稀釋成20 倍質(zhì)量濃度差的溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為 0.63%、1.11%、0.76%、0.59%、1.02%、1.17%、0.80%、1.25%、1.39%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸含有量RSD 分別為1.02%、1.66%、1.24%、0.97%、1.57%、0.43%、1.39%、1.78%、0.86%、1.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為0.59%、1.08%、0.72%、0.61%、0.99%、1.23%、0.85%、1.19%、1.44%、1.10%，表明溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批各成分含有量已知的顆粒適量，研細(xì)，取9 份，每3 份為1 組，每份約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部要求，將高、中、低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液加入量與供試品溶液中待測(cè)成分含有量的比例分別控制在1.5∶1、1∶1、0.5∶1，精密加入對(duì)照品溶液（含毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 0.338 mg／mL、芒柄花苷0.218 mg／mL、芒柄花素0.473 mg／mL、升麻素苷1.123 mg／mL、升麻素0.327 mg／mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷 0.639 mg／mL、亥茅酚苷0.287 mg／mL、去氫土莫酸0.119 mg／mL、去氫茯苓酸0.082 mg／mL、茯苓酸0.159 mg／mL） 0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸平均加樣回收率分別為98.41%、97.65%、99.08%、100.01%、98.10%、99.94%、98.29%、97.34%、96.91%、97.93%，RSD 分別為1.21%、1.53%、0.93%、0.77%、1.39%、0.66%、1.65%、1.41%、0.96%、1.14%。

2.6 樣品含有量測(cè)定 取3 批顆粒，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 保兒寧顆粒中黃芪補(bǔ)脾益肺，固表止汗，而白術(shù)健脾扶正，補(bǔ)中焦而滋氣血之源，合為君藥；山藥健脾補(bǔ)肺，益腎填精，而茯苓滲濕健脾，寧心安神，可增芪術(shù)之效，合為臣藥；防風(fēng)祛風(fēng)邪，而蘆根防久補(bǔ)生熱，合為佐藥；雞內(nèi)金和胃健脾，為使藥，諸藥合用，共奏益氣固表、健中醒脾之功效。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，臣、佐、使藥兼顧的確定原則［21-24］，本實(shí)驗(yàn)選擇方中炙黃芪所含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，茯苓所含去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸，防風(fēng)所含升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷作為指標(biāo)成分，可實(shí)現(xiàn)保兒寧顆粒中多成分的質(zhì)量控制。

3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)首先考察了提取溶劑（50%甲醇［17］、甲醇［16，18-20，25］、50%乙醇、乙醇），發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑時(shí)各成分綜合提取率最佳，再考察了提取方式（超聲［16，19-20，25］、加熱回流［17-18］）、提取時(shí)間 （15 min、30 min、45 min）對(duì)各成分綜合提取效果的影響。最終，確定甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液制備方法。

3.3 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)首先采用不同比例甲醇-水、乙腈-水梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)無法兼顧各成分的分離度、峰形、出峰時(shí)間。參考文獻(xiàn)［25］，以乙腈-甲醇（9∶1） 與水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)上述情況有了明顯改善，但色譜圖基線仍存在漂移現(xiàn)象，并且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，芒柄花苷、去氫茯苓酸存在拖尾，故又在水相中加入適量酸（0.1%甲酸［16］、0.1%磷酸［19-20］、0.1% 冰醋酸），同時(shí)對(duì)流動(dòng)相比例不斷調(diào)整。最終，確定乙腈-甲醇 （9∶1） 與0.1%甲酸作為流動(dòng)相，按“2.1”項(xiàng)下比例進(jìn)行梯度洗脫。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定保兒寧顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含有量，發(fā)現(xiàn)該方法簡(jiǎn)便可靠，檢測(cè)時(shí)間短，可為該制劑質(zhì)量控制和綜合評(píng)價(jià)提供依據(jù)。