郭海姣，覃潔萍*，劉 雯，梁梓敏，陳文潔，羅宇東

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬制藥廠，廣西南寧 530023）

穿黃制劑由穿心蓮、一枝黃花2 味藥材組成，具有清熱解毒的功效，臨床上用于治療急性上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽喉炎等疾?。?］。其中，穿心蓮提取物的有效成分主要為穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯，具有解熱、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用［2-3］；一枝黃花提取物含有多種咖啡?？鼘幩犷惓煞?，包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸及異綠原酸A、B、C，均具有抗炎解熱、抗菌抗病毒、祛痰平喘等活性［4-6］。但該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量進(jìn)行測定［7-8］，難以全面控制其質(zhì)量。

課題組前期建立了HPLC 法測定穿黃制劑中上述10 種成分的含有量，可在同一色譜條件下同時(shí)進(jìn)行，而且方法簡單、快速、準(zhǔn)確。但該方法需要10 種對照品，而且有一些（如異綠原酸類、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯等）價(jià)格昂貴，從而限制了在多指標(biāo)成分質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

一測多評法依據(jù)中藥有效成分之間存在某些內(nèi)在關(guān)系的特性，只需測定某一內(nèi)標(biāo)即可計(jì)算其他成分的含有量［9-10］。穿黃制劑中主要含有咖啡酰奎寧酸類、二萜內(nèi)酯類成分，符合一測多評法的使用原則，而且綠原酸、穿心蓮內(nèi)酯對照品價(jià)廉易得，故本實(shí)驗(yàn)分別以兩者為上述2 類成分的內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他8 種成分的相對校正因子，測定其含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260、Waters e2695、島津LC-2030 Plus 高效液相色譜儀；密思博超純水器；電子分析天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；TGL-16G 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 乙腈為色譜純（美國Fisher 公司，批號186356）；甲醇、乙醇等其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 對照品 新綠原酸（批號6603）、隱綠原酸（批號3208）、異綠原酸B（批號3089）對照品均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；綠原酸（批號110753-201817）、穿心蓮內(nèi)酯（批號 110797-200307）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號110854-200306）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A（批號180307）、異綠原酸C（批號180126）對照品均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；新穿心蓮內(nèi)酯（批號20171215）、去氧穿心蓮內(nèi)酯（批號A2025J08）對照品均購自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司。經(jīng)HPLC 測定，各對照品純度均大于98%。

1.4 藥材 一枝黃花產(chǎn)于貴州省都勻市墨沖鎮(zhèn)，穿心蓮產(chǎn)于廣東省湛江市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室蔡毅教授鑒定，分別為菊科植物一枝黃花Solidago decurrensLour 和爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.） Nees，均符合2015 年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。

1.5 制劑 穿黃清熱片源自廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠（批號20171101、20161201），穿黃清熱膠囊源自廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室（批號20190408、20190413、20190418、20190421）、山西華元醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司（批號20180101、20180701、20180704）、吉林省康福藥業(yè)有限公司（批號20171106、20180303）、四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號20180504、20180905）、江西銀濤藥業(yè)有限公司（批號20190201）、湖北端正藥業(yè)有限公司（批號20190101）、重慶三峽云海藥業(yè)有限公司（批號190301NO·043）。以上制劑的有效期均為2 年。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 Agilent Technologies EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10% A；10～15 min，10%～15%A；15～20 min，15%～21%A；20～30 min，21% A；30～40 min，21%～28% A；40～50 min，28%～34%A；50～65 min，34%～36%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長323 nm（0～35 min）、215 nm（35～65 min）；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于10 個(gè)5 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，各取適量置于同一5 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成分別含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯0.184、0.258、0.202、0.260、0.178、0.093 4、0.652、1.034、0.234、1.132 mg／mL 的貯備液，精密吸取0.5 mL 于2 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（各成分含有量分別為0.046、0.064 5、0.050 5、0.065、0.044 5、0.023 4、0.163、0.258、0.058 5、0.283 mg／mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 取穿黃清熱片20 片，去掉薄膜衣；取穿黃清熱膠囊10 粒，傾出內(nèi)容物，均研細(xì)過5 號篩，各取約1.0 g，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超聲（200 W、40 kHz）提取30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液離心（13 000 r／min），上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按制劑處方和工藝，制備缺一枝黃花、缺穿心蓮的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，對照品、供試品在相應(yīng)位置具有相同保留時(shí)間的色譜峰，兩者UV 光譜一致；各成分色譜峰分離度均達(dá)到1.5以上，符合含有量測定要求。理論塔板數(shù)以異綠原酸C 計(jì)，均不低于41 000。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的對照品溶液各5 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，分別以S／N ＝3、S／N＝10為檢測限、定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液5 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得各成分峰面積RSD 均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（批號20171101） 5 μL，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD 均小于2%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取制劑 （批號20171101） 6 份，每份1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL 測定，測得各成分含有量RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的制劑（批號20171101） 0.5 g，共6 份，精密加入含新綠原酸（0.574 mg／mL）、綠原酸（0.806 mg／mL）、隱綠原酸（0.629 mg／mL）、異綠原酸B（0.814 mg／mL）、異綠原酸 A （0.556 mg／mL）、異綠原酸 C（0.292 mg／mL）、穿心蓮內(nèi)酯 （0.588 mg／mL）、新穿心蓮內(nèi)酯（3.230 mg／mL）、去氧穿心蓮內(nèi)酯（0.732 mg／mL）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（3.535 mg／mL）的對照品溶液1.00 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL 測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯平均加樣回收率分別為102.8%、102.1%、100.9%、100.0%、100.3%、101.7%、98.6%、102.9%、98.6%、100.8%，RSD 分別為0.8%、1.4%、2.3%、1.3%、1.3%、2.0%、1.3%、0.55%、1.2%、1.3%。

2.2 相對校正因子測定 精密吸取“2.1.6”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以綠原酸、穿心蓮內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算其他5 種咖啡?？鼘幩?、3 種二萜內(nèi)酯的相對校正因子（fs／k），公式為fs／k＝fs／fk＝ （As×Ck） ／ （Ak×Cs），其中As為內(nèi)標(biāo)峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含有量，Ak為待測成分峰面積，Ck為待測成分含有量，結(jié)果見表2。由此可知，各成分相對校正因子RSD 小于2%，表明其準(zhǔn)確度良好。

表2 各成分相對校正因子（n＝6）Tab.2 Relative correction factors of various constituents （n＝6）

2.3 色譜峰定位 目前，常用的色譜峰定位方法有相對保留時(shí)間法和保留時(shí)間差法［11］。本實(shí)驗(yàn)先以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，測定其他9 種成分在3 臺色譜儀（Agilent 1260、Waters e2695、島津LC-2030 Plus）、3 根色譜柱［Agilent Technologies EC-C18（4.6 mm×250 mm，4 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）、Waters SunFire ?C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）］上的相對保留時(shí)間和保留時(shí)間差，結(jié)果見表3。由此可知，采用相對保留時(shí)間法時(shí)僅新綠原酸、隱綠原酸RSD 小于5%，而采用保留時(shí)間差法時(shí)新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B RSD 仍大于5%，不符合相關(guān)要求［10］。

因此，本實(shí)驗(yàn)考慮同時(shí)選擇綠原酸、穿心蓮內(nèi)酯作為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他8 種成分的相對調(diào)整保留值，結(jié)果見表4，可知除了2 種內(nèi)標(biāo)外各成分RSD均小于5%，而內(nèi)標(biāo)可采用相對保留時(shí)間法進(jìn)行定位。綜上所述，相對調(diào)整保留值結(jié)合相對保留時(shí)間可實(shí)現(xiàn)對全部成分的準(zhǔn)確定位。

為了考察該方法準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)取3 個(gè)質(zhì)量濃度對照品溶液，在不同儀器、色譜柱下測定其保留時(shí)間預(yù)測值，并與相同條件下的實(shí)測值進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。由此可知，2 類數(shù)值接近，RSD 在0.1%～5%之間，符合相關(guān)要求［10］。

2.4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響 以綠原酸、穿心蓮內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，測定其他8 種成分在“2.2.2”項(xiàng)儀器、色譜柱下的相對校正因子，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表3 各成分相對保留時(shí)間、保留時(shí)間差（內(nèi)標(biāo)綠原酸， n＝3）Tab.3 Relative retention time and retention time differences of various constituents （with chlorogenic acid as an internal standard， n＝3）

表4 各成分相對調(diào)整保留值（n＝3）Tab.4 Relative adjusted retention values of various constituents （n＝3）

2.5 不同柱溫、體積流量對相對校正因子的影響 采用Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent Technologies EC-C18色譜柱，考察在柱溫25、30、35 ℃，以及體積流量0.8、1.0、1.2 mL／min 下的相對校正因子，結(jié)果見表7，可知均無明顯影響（RSD＜1%）。

2.6 樣品含有量測定 取17 批制劑，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法測定各成分含有量，結(jié)果見表8。由此可知，2 種方法所得結(jié)果接近，RSD 均小于3%。

表5 各成分保留時(shí)間（n＝3）Tab.5 Retention time of various constituents （n＝3）

表6 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響（n＝3）Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative correction factors （n＝3）

表7 不同柱溫、體積流量對相對校正因子的影響（n＝3）Tab.7 Effects of different column temperatures and volumetric flow rates on relative correction factors （n＝3）

表8 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

僅以綠原酸或穿心蓮內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)時(shí)，不能達(dá)到其他9 種成分在不同儀器、色譜柱上相對校正因子RSD 小于3%的要求，故本實(shí)驗(yàn)以綠原酸為咖啡?？鼘幩犷惓煞值膬?nèi)標(biāo)，穿心蓮內(nèi)酯為二萜內(nèi)酯類成分的內(nèi)標(biāo)，發(fā)現(xiàn)2 類成分RSD 均小于3%，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

在待測色譜峰定位方法的選擇方面，本實(shí)驗(yàn)比較了目前相關(guān)文獻(xiàn)常用的相對保留時(shí)間法和保留時(shí)間差法，發(fā)現(xiàn)以綠原酸或穿心蓮內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)時(shí)，上述2 種方法均不能實(shí)現(xiàn)對所有成分的準(zhǔn)確定位，再采用文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道的兩點(diǎn)校正定位法，但結(jié)果仍不理想。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以綠原酸、穿心蓮內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，通過計(jì)算其他成分色譜峰相對調(diào)整保留值結(jié)合相對保留時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)了各成分的準(zhǔn)確定位，其色譜峰在不同色譜條件下的預(yù)測值與實(shí)測值基本一致，RSD 均小于5%，符合一測多評法相關(guān)要求。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一測多評法同時(shí)測定穿黃片、穿黃膠囊中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含有量，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與外標(biāo)法接近，RSD 均小于3%。同時(shí)，該方法操作簡便，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于上述制劑的質(zhì)量控制。