鄭教雀 葉裕香吳方達 何 強 張夢迪 陳序傳

（福建省寧德市動物疫病預(yù)防控制中心 福建寧德 352100）

豬瘟及豬偽狂犬病是制約我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展的兩種重要疾病。它們均能引起母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等問題；同時，還能使豬群免疫力下降、接種疫苗后不易產(chǎn)生有效抗體；此外，它們還能引起多種病原混合感染，使豬的死亡率急劇增加，給豬場帶來巨大經(jīng)濟損失。

為了掌握豬瘟及豬偽狂犬病在閩東地區(qū)豬群中的感染情況，對2017-2019年收集自寧德市9個屠宰場及隨機抽取的48個規(guī)模養(yǎng)殖場883份組織樣品進行病原檢測、5 590份血清樣品進行血清學(xué)檢測。再對檢測結(jié)果進行分析、討論，得到兩種疫病在閩東地區(qū)的流行現(xiàn)狀及規(guī)律，進而為寧德市制定科學(xué)的預(yù)防、控制措施及疫病凈化奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 樣品來源

1.1.1 病原學(xué)樣品 采集對象主要為寧德市9個縣（市、區(qū)）的定點屠宰場。按置信水平95%、試驗的敏感性95%、預(yù)定流行率10%計算，每個監(jiān)測點采樣20～30份；同時，根據(jù)豬瘟及豬偽狂犬病流行規(guī)律，每年選擇在3～4月、11～12月監(jiān)測2次。此外，按照要求選取寧德市9個縣（市、區(qū)）動物疫控中心所采集的臨床發(fā)病樣品，每季度開展一次病原學(xué)檢測。

1.1.2 血清學(xué)樣品 采集對象除了寧德市各縣（市、區(qū)）的9家定點屠宰場之外，還有48個規(guī)模養(yǎng)殖場。這48個規(guī)?；B(yǎng)殖場選取原則為，按照預(yù)期場間流行率為5%、可接受誤差5%，置信度95%，在全市建檔的140家規(guī)?；B(yǎng)殖場中隨機抽取得到。每家規(guī)模場采樣數(shù)量按照估計流行率原則進行抽樣，設(shè)置置信水平95%、可接受絕對誤差10%、預(yù)期流行率90%，計算得到每個監(jiān)測點采集樣品35份。與病原學(xué)樣品一樣，也是選擇每年在3～4月、11～12月監(jiān)測2次。

1.1.3 樣品采集、運輸與保存 采集全血后，應(yīng)該以最快的速度將所采集的樣品送往實驗室，再依據(jù)試驗要求及時進行血清分離。所采集的組織樣如果能在24 h內(nèi)送達實驗室，則可以放在4℃左右的容器中運送；如果在24 h內(nèi)不能將樣品送到實驗室且不致影響試驗檢測結(jié)果的情況下，可以將樣品冷凍并以此狀態(tài)運送。具體依據(jù) 《動物疫病實驗室檢驗采樣方法》（NY/T541-2002）對樣品進行采集、保存及運輸。

1.1.4 問卷調(diào)查和登記表 為更好地掌握寧德市規(guī)模化養(yǎng)殖場的具體情況，在采樣開始之前設(shè)計相關(guān)調(diào)查問卷及登記表，調(diào)查問卷內(nèi)容主要包括規(guī)模場所處的地理位置、飼養(yǎng)管理情況、主要疫病免疫背景、近期發(fā)生疫病情況等，讓采樣對象相關(guān)工作人員在采樣的同時填寫調(diào)查問卷、登記表。

1.2 主要試劑 CSFV、PRV gB和gE抗體ELISA檢測試劑盒均購自IDEXX生物科技有限公司；CSFV熒光RT-PCR檢測試劑盒購自上海輝銳生物科技有限公司，PRV熒光PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑、耗材和藥品主要購自生工生物工程 (上海)股份有限公司。

1.3 主要設(shè)備 高速臺式冷凍離心機、SW-CJ凈化工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、Tecan infinite F50酶標(biāo)儀、普朗DNM-9602酶標(biāo)分析儀、Brand可調(diào)微量移液器、QIAGEN TissueLyserⅡ、天隆NP968-C核酸提取儀、Applied Biosystems Step One Real-Time PCR Systems。

2 方 法

2.1 CSFV、PRV gB和gE抗體ELISA檢測 按照IDEXX生物科技有限公司試劑盒使用說明書所提供的方法，同時結(jié)合《豬瘟診斷技術(shù)》（GB/T16551-2008）及《偽狂犬病診斷技術(shù)》（GB/T18641-2002.6）進行檢測。

2.2 豬瘟病毒及豬偽狂犬病病毒檢測

2.2.1 核酸提取 使用天隆NP968-C核酸提取儀自動提取 RNA（DNA），具體方法如下：（1）在 96 孔板的第1、7列各孔中分別加入20 μL蛋白酶K、200 μL樣本；陰性、陽性對照參與提取。（2）按表1程序進行自動化提取。（3）自動化程序結(jié)束后，第6、12列中的液體即為RNA（DNA）。

2.2.2 豬瘟病毒擴增 使用上海輝銳生物科技有限公司CSFV熒光RT-PCR檢測試劑盒進行擴增。從試劑盒中取出RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2 000 r/min瞬時離心。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=樣本數(shù)＋1管陰性對照＋1管陽性對照），取RTPCR 反應(yīng)液 15*n μL，Taq 酶 0.25*n μL， 加入至合適的離心管中；再取n/4顆RT-PCR酶顆粒加入離心管，充分混合均勻，2 000 r/min瞬時離心，向每個PCR管中各分裝15 μL。

向PCR管中分別加入上述核酸提取步驟中制備的RNA溶液各10 μL，蓋緊管蓋，瞬時離心。將PCR管放入PCR熒光檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序，設(shè)置程序進行以下反應(yīng)：42℃、30 min；92℃、3 min； 循環(huán) 92 ℃、10 s，45 ℃ 30 s，72 ℃、60 s，共5次；循環(huán) 92 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共 40次，每次循環(huán)的第二步（60℃、30 s）收集熒光信號（報告基團“FAM”，淬滅基團“None”）；40 ℃、1 s。反應(yīng)體系設(shè)置為 25 μL。

2.2.3 豬偽狂犬病病毒擴增 使用北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司PRV熒光PCR檢測試劑盒進行擴增。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=樣本數(shù)＋1管陰性對照＋1管陽性對照），取無菌無核酸酶水5.9*（n＋1）μL，PCR 反應(yīng)液 10*（n＋1）μL，熒光探針 2.1*（n＋1）μL，加入至合適的離心管中，向每個PCR管中各分裝 18 μL。

向PCR管中分別加入上述核酸提取步驟中制備的DNA溶液各2 μL，蓋緊管蓋，瞬時離心。將PCR管放入PCR熒光檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序，設(shè)置程序進行以下反應(yīng)：95℃、2 min；循環(huán)95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，共 40次，每次循環(huán)的第二步（60 ℃、35 s）收集熒光信號（報告基團“FAM”，淬滅基團“None”）。 反應(yīng)體系設(shè)置為 20 μL。

表1 豬瘟病毒病原檢測自動化提取步驟表

2.3 試驗結(jié)果判斷 陽性對照Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，試驗結(jié)果成立。

被檢樣品Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，判定為陽性；被檢樣品30＜Ct＜35并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提取DNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判定為陽性；被檢樣品Ct值≥35時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性。

3 流調(diào)結(jié)果

本調(diào)查對2017-2019年在寧德市所收集的樣品采用ELISA方法進行抗體檢測，采用熒光定量（RT-）PCR方法進行病原檢測，結(jié)果如下（見表2-表 5）。

2017年檢測寧德市9個屠宰場組織樣品198份，豬瘟病毒個體陽性率2.5%，豬偽狂犬病病毒個體陽性率4.0%；9個屠宰場檢測血清360份，豬瘟抗體個體合格率91.1%，豬偽狂犬病gB抗體個體合格率80.6%，gE抗體個體陽性率10.6%。檢測寧德市48個規(guī)模豬場組織樣品140份，豬瘟病毒個體陽性率2.9%，豬偽狂犬病病毒個體陽性率4.3%；48個規(guī)模豬場檢測血清1 680份，豬瘟抗體個體合格率82.0%，豬偽狂犬病gB抗體個體合格率70.1%，gE抗體個體陽性率17.9%。

2018年檢測寧德市9個屠宰場組織樣品185份，豬瘟病毒個體陽性率1.6%，豬偽狂犬病病毒個體陽性率2.7%；9個屠宰場檢測血清360份，豬瘟抗體個體合格率90.0%，豬偽狂犬病gB抗體個體合格率83.9%，gE抗體個體陽性率4.2%。檢測寧德市46個規(guī)模豬場組織樣品112份，豬瘟病毒個體陽性率2.7%，豬偽狂犬病病毒個體陽性率3.6%；46個規(guī)模豬場檢測血清1 610份，豬瘟抗體個體合格率82.9%，豬偽狂犬病gB抗體個體合格率75.3%，gE抗體個體陽性率12.9%。

2019年檢測寧德市8個屠宰場組織樣品168份，豬瘟病毒個體陽性率0.6%，豬偽狂犬病病毒個體陽性率0.6%；8個屠宰場檢測血清320份，豬瘟抗體個體合格率88.1%，豬偽狂犬病gB抗體個體合格率87.5%，gE抗體個體陽性率1.6%。檢測寧德市36個規(guī)模豬場組織樣品80份，豬瘟病毒個體陽性率1.3%，豬偽狂犬病病毒個體陽性率2.5%；36個規(guī)模豬場檢測血清1 260份，豬瘟抗體個體合格率86.0%，豬偽狂犬病gB抗體個體合格率80.5%，gE抗體個體陽性率8.8%。

表2 2017-2019年屠宰場豬瘟、豬偽狂犬病病原學(xué)檢測統(tǒng)計表

表3 2017-2019年屠宰場豬瘟、豬偽狂犬病血清學(xué)檢測統(tǒng)計表

表4 2017-2019年規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病病原學(xué)檢測統(tǒng)計表

表5 2017-2019年規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病血清學(xué)檢測統(tǒng)計表

4 結(jié)果分析

經(jīng)過對流調(diào)結(jié)果進行分析可以看到：2017-2019年，不論是屠宰場還是規(guī)模場，二者的豬瘟、豬偽狂犬病病原學(xué)陽性率都呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，而且屠宰場的下降幅度較規(guī)模場要明顯許多，至2019年，屠宰場兩種病的病原學(xué)陽性率都控制在1%以內(nèi)。見圖1。

血清學(xué)檢測所得的有效抗體合格率，其趨勢則不盡相同。就偽狂犬病gB抗體合格率而言，屠宰場、規(guī)模場都呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，且每年的合格率都在70%以上；偽狂犬病gE抗體陽性率都表現(xiàn)出逐年下降。豬瘟抗體合格率在規(guī)模場表現(xiàn)出上升趨勢，而屠宰場則呈下降趨勢，見圖2。

5 討 論

一方面，2017年國家取消對豬瘟強制免疫；另一方面，2018年8月非洲豬瘟傳入我國。考慮到生物安全等因素，大部分豬場工作重心都有所轉(zhuǎn)移，從而忽略了豬瘟、豬偽狂犬病等舊病的危害。

2020年作為國家中長期動物疫病防治規(guī)劃的收官之年，動物疫病凈化工作顯得尤為重要。本流調(diào)報告通過對全市屠宰場、規(guī)模場收集的樣品進行檢測、統(tǒng)計分析，得到寧德市近些年豬瘟、豬偽狂犬病的流行趨勢，為寧德市豬瘟、豬偽狂犬病等疾病的凈化奠定了基礎(chǔ)，為完成我省的中長期動物疫病防治規(guī)劃提供有力保障。