鄭小蘭 程龍飛 黃 瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013）

禽霍亂是一種由多殺性巴氏桿菌引起的侵害各種家禽和野禽的接觸性傳染病[1]，臨床上可表現(xiàn)為急性型和慢性型。急性型以高熱和呼吸困難為特征，多發(fā)生于成年禽或產(chǎn)蛋禽，發(fā)病急、病程短，往往看見癥狀后不久即死亡，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。慢性型則多表現(xiàn)為局部性感染，如關(guān)節(jié)炎或肉髯炎等。多殺性巴氏桿菌對(duì)多種藥物敏感，發(fā)病時(shí)，飼喂多種藥物均能較容易控制該病，但停藥后極易復(fù)發(fā)，反復(fù)用藥易使多殺性巴氏桿菌獲得耐藥性，影響復(fù)發(fā)后的治療。因此，臨床上藥物的選擇顯得尤其重要。本研究近期從福州周邊地區(qū)分離到3株鴨源多殺性巴氏桿菌，對(duì)其血清型和藥物敏感性進(jìn)行測(cè)定，為鴨源多殺性巴氏桿菌的血清流行病學(xué)調(diào)查和近期臨床治療藥物的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 福州市晉安區(qū)林某飼養(yǎng)的2 000羽產(chǎn)蛋麻鴨，140日齡左右突然發(fā)病，死亡13羽。福清市陳某飼養(yǎng)的800羽半番鴨，55日齡時(shí)發(fā)病，死亡6羽。福州市閩侯縣林某飼養(yǎng)的1 000羽番鴨，于76日齡時(shí)發(fā)病，死亡5羽。3份病料的剖檢病變相似，均可見程度不同的心冠脂肪出血；肝臟腫大質(zhì)脆、可見非常多針尖至針頭大小的灰白色小點(diǎn)；腸道腫脹至正常的2～3倍，剪開可見內(nèi)容物呈膠凍樣，有的混有血液。

1.2 試劑及配制 Tryptic soy Agar（美國(guó)BD公司產(chǎn)品），取4 g加入100 mL蒸餾水中，121℃高壓15 min，自然冷卻至60℃左右分裝制成TSA平板，保存于4℃冰箱；馬丁氏肉湯（海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），取53.5 g加入1 000 mL蒸餾水中，116℃高壓30 min，自然冷卻后保存于4℃冰箱；生化鑒定管，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，北京天壇藥物生物科技有限公司產(chǎn)品；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全氏金生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌的分離及純化 凈化工作臺(tái)內(nèi)，取肝組織劃線接種于TSA平板，37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取平板上散在、圓形凸起、邊緣整齊、半透明、直徑約1 mm的小菌落，再次劃線于TSA平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑取6～10個(gè)菌落接種于馬丁氏肉湯，37℃培養(yǎng)18 h。

1.4 細(xì)菌的初步鑒定 取少量菌液，進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢。取少量菌液，接種生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24 h，觀察生化鑒定管，按說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 細(xì)菌的PCR鑒定

1.5.1 核酸提取及定量 吸取菌液1.5 mL，8 000 g離心5 min，棄上清，按DNA/RNAKit的操作規(guī)程提取核酸。取1 μL核酸以NANODROP 2000測(cè)定其核酸濃度，調(diào)整到100 ng/μL作為模板。3株細(xì)菌分別進(jìn)行。

1.5.2 菌種鑒定和莢膜型鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[2]合成多殺性巴氏桿菌的種特異性引物、莢膜A型鑒定引物，見表1。兩種鑒定分別進(jìn)行。配制50 μL的PCR反應(yīng)體系，其中 2×Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 程序： 94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 45 s，56℃退火 40 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次；72℃ 延伸10 min。取PCR產(chǎn)物4 μL以1%瓊脂糖凝膠（含GoldView）電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。將PCR產(chǎn)物送福州博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將序列上傳至GenBank進(jìn)行比對(duì)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)采用紙片法。取少量新鮮菌液均勻涂布于TSA平板，待菌液吸收后，將藥敏紙片按一定間距擺放在平板上，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察，量取每個(gè)藥敏紙片抑菌圈的直徑，按中國(guó)藥檢所制定的標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的初步鑒定 3個(gè)病例的肝臟接種TSA平板，培養(yǎng)后均可見大小、形態(tài)一致的菌落，菌落凸起于培養(yǎng)基，呈圓形，邊緣整齊，大小約1 mm，半透明樣。3株細(xì)菌分別命名為 FJ2017、FJ2022、FJ2039。革蘭氏染色，3株均為陰性短桿菌；瑞氏染色呈兩極著染的小桿菌。生化試驗(yàn)結(jié)果見表2，3株細(xì)菌均可分解葡萄糖、蔗糖和果糖，甲基紅試驗(yàn)和VP試驗(yàn)均為陰性，觸酶和氧化酶均為陽性，均可產(chǎn)生硫化氫，符合巴氏桿菌的特征。

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定 3株細(xì)菌均可擴(kuò)增出近500 bp的單一條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的大小相符。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)，同源性在99%以上的均為多殺性巴氏桿菌，證實(shí)3株細(xì)菌均為多殺性巴氏桿菌。細(xì)菌的莢膜型PCR鑒定，3株細(xì)菌均可擴(kuò)增出近1 000 bp的單一條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的大小相符。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)，同源性在99.5%以上的均為莢膜A型多殺性巴氏桿菌，證實(shí)3株細(xì)菌的莢膜型均為A型。見圖1。

2.3 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 3株細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見表3。所有菌株都表現(xiàn)出對(duì)8種及以上藥物的多重耐藥性，說明鴨源多殺性巴氏桿菌臨床分離菌株具有較強(qiáng)的藥物耐受性。3株細(xì)菌均耐受的藥物有鏈霉素、四環(huán)素、克林霉素和青霉素；均敏感的藥物有恩諾沙星、多黏菌素B、復(fù)方新諾明和頭孢唑啉。

3 討 論

多殺性巴氏桿菌可侵害多種家禽和家畜，引起豬肺疫，牛、羊、兔等的出血性敗血癥，禽霍亂等。根據(jù)莢膜抗原的不同，可以將多殺性巴氏桿菌劃分為A、B、D、E、F共5個(gè)莢膜型。除火雞分離到莢膜F型多殺性巴氏桿菌外[3]，其余禽源多殺性巴氏桿菌的莢膜型幾乎為A型，偶有D型[1]和F型菌株[3]。近兩年，陳國(guó)權(quán)等[4]從貴州的發(fā)病肉鴨、程增青等[5]從河南的發(fā)病蛋鴨、王紅琳等[6]從湖北的發(fā)病蛋鴨都分離到多殺性巴氏桿菌，經(jīng)鑒定，莢膜型均為A型。本研究的結(jié)果與他們相同，也是莢膜A型多殺性巴氏桿菌，說明流行于我國(guó)的鴨源多殺性巴氏桿菌，其莢膜的血清型沒有發(fā)生變化，仍是A型占了絕大多數(shù)。

表1 引物的序列

表2 3株細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

陳國(guó)權(quán)等[4]從貴州的患病肉鴨中分離的多殺性巴氏桿菌，對(duì)多數(shù)頭孢類、喹諾酮類、氟苯尼考、慶大霉素等敏感，對(duì)磺胺類、四環(huán)素和多數(shù)青霉素類耐藥。王紅琳等[6]從湖北發(fā)病蛋鴨分離的多殺性巴氏桿菌，對(duì)諾氟沙星等喹諾酮類、丁胺卡那霉素、新霉素、克林霉素和阿奇霉素敏感，對(duì)磺胺類、頭孢類、氟苯尼考、鏈霉素、四環(huán)素等耐藥。從中可以看出，不同地區(qū)流行的鴨源多殺性巴氏桿菌，對(duì)藥物的敏感性不同。而不同時(shí)間流行的鴨源多殺性巴氏桿菌，對(duì)藥物的敏感性也不相同，比如，同樣是福建分離的菌株，劉小龍等[7]2015年分離的3株菌株，均敏感的藥物有氟苯尼考和復(fù)方新諾明，均耐受的藥物有卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、林可霉素和青霉素。本研究2020年分離的3株菌株，全部敏感的藥物有恩諾沙星、多黏菌素B、復(fù)方新諾明和頭孢唑啉，全部耐受的藥物有鏈霉素、四環(huán)素、克林霉素和青霉素。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的原因是多方面的，主要與養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)時(shí)間、不規(guī)范的藥物應(yīng)用有關(guān)。本研究結(jié)果提示，近期在福州及周邊地區(qū)的養(yǎng)鴨場(chǎng)，治療禽霍亂時(shí)，優(yōu)先選用恩諾沙星等喹諾酮類、磺胺類和頭孢類藥物。治療過程中不應(yīng)延長(zhǎng)抗菌藥物的使用療程。