陳 琪，鐘 茜*，岳文濤，*

(1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實驗室，北京 100026；2．華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室/中山大學(xué)腫瘤防治中心/腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510060)

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。中國南部是全球范圍內(nèi)鼻咽癌發(fā)病率最高的地區(qū)，每年全球約40%的新增鼻咽癌病例發(fā)生于中國南部地區(qū)[1]，發(fā)病率約為0.2‰～0.3‰[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染及其編碼的致癌因子潛伏膜蛋白1(latent membrane protein-1，LMP1)是鼻咽癌重要的影響因子[3-7]。但是，雖然EBV攜帶率高達90%～95%[8]，卻不是每個攜帶者都會發(fā)生鼻咽癌。因此，尋找更多EBV之外的鼻咽癌致癌因子對于深入了解鼻咽癌發(fā)病機制，尋找鼻咽癌診斷和治療靶點具有重要的意義。

RNA結(jié)合蛋白是RNA轉(zhuǎn)錄，miRNA加工，DNA損傷反應(yīng)，Th2細胞分化過程的重要影響因子[9-10]。本課題組之前的研究[11]發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合基元蛋白24(RNA-binding motif protein 24，RBM24)在鼻咽癌組織中表達量顯著低于癌旁組織。這提示我們，RBM24可能對鼻咽癌起抑制作用。但是，RBM24影響腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的通路和機制仍不明確。

作為一種長鏈非編碼RNA，HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)在鼻咽癌組織中表達量顯著升高[12-13]，敲除HOTAIR后鼻咽癌細胞增殖顯著減慢[12]。目前在鼻咽癌中RBM24與HOTAIR的關(guān)聯(lián)尚未見報道。研究[14]表明，在乳腺癌、前列腺癌和前列腺良性病變細胞中，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasisassociatedlung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)能夠結(jié)合到HOTAIR的啟動子區(qū)，參與調(diào)控基因表達。在鼻咽癌中，RBM24可以調(diào)控MALAT1表達[11]，MALAT1可能也會結(jié)合到HOTAIR的啟動子區(qū)并調(diào)控其表達。因此我們推測，鼻咽癌中RBM24可能與HOTAIR存在關(guān)聯(lián)。故本文擬探討RBM24是否通過調(diào)控HOTAIR來影響鼻咽癌細胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、角化細胞培養(yǎng)基(keratinocyte/serum-free medium，KSFM)、RNAiMAX均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。siRNA和隨機對照購自廣州銳博生物科技有限公司。GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)購自美國Promega公司。SYBR Green PCR master mix購自美國Bio-Rad公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本Dojindo公司。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測使用Light Cycler 480 II System(Roche)儀器。

1.2 細胞培養(yǎng)與RBM24敲低

鼻咽癌細胞CNE1為本實驗室所保存，使用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。永生化鼻咽上皮細胞N5為本實驗室所保存，NP69來源于香港中文大學(xué)解剖系，均使用K-SFM培養(yǎng)。所有細胞于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)，均采用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

每種細胞分為3組進行，即隨機對照組、siRBM24-1轉(zhuǎn)染組、siRBM24-2轉(zhuǎn)染組。每組細胞按照每孔3×105個細胞接種于6孔板，24 h后用RNAiMAX試劑進行轉(zhuǎn)染，按照說明書操作。即分別將 25 pmol siRNA、 7.5 μL RNAiMAX 用 150 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，將稀釋混合液室溫孵育5 min后加入細胞中進行轉(zhuǎn)染，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)72 h，收集細胞。siRNA和隨機對照購自廣州銳博生物科技有限公司。RBM24敲低時siRBM24-1使用的序列為：CCCTTATACAAAGACCT TT；siRBM24-2使用的序列為：GAGCTGCATACGCA CAATA。

1.3 RNA表達量檢測

每種細胞經(jīng)過對照組siRNA或RBM24 siRNA轉(zhuǎn)染72 h后，收集細胞沉淀，加入1 mL Trizol重懸，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，旋渦振蕩15 s，室溫放置5 min后，4℃、12 000 g離心15 min，吸取上層無色液體至新的EP管中。加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min后，4℃、12 000 g離心10 min。用75%乙醇洗滌RNA沉淀，并置于空氣中干燥10 min后，用DEPC ddH2O溶解細胞總RNA。

使用GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑，按照說明書操作，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用1 μL cDNA(20 μL反應(yīng)體系)進行實時熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸60 s，變性、退火、延伸循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參。試驗重復(fù)3次。采用相對定量方法(2-ΔΔCT>)對結(jié)果進行分析。qPCR使用的引物序列(5′-3′)如下：RBM24-F，CCAAGGATCATGCAACCAG；RBM24-R， GCAGGTATCCCGAAAGGTCT。 HOTAIR-F， CAG TGGGGAACTCTGACTCG； HOTAIR-R， GTGCCTGGT GCTCTCTTACC。 GAPDH-F， AACTCTGGTAAAGTGG ATATTG；GAPDH-R，GGTGGAATCATATTGGAACA。

1.4 細胞增殖率檢測

在96孔板中每孔加入1 000個細胞，每種細胞分為隨機對照組和RBM24敲低組，每個處理組重復(fù)3次。敲低后24 h，在RBM24敲低組和對照組中分別加入10 μL CCK-8，處理2 h后檢測細胞D(450)值。此外，在敲低后第2～5天，每天檢測D(450)值，并分析細胞增殖情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，兩組間差異用Student'st檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 RBM24敲低對RBM24 mRNA表達量的影響

qPCR結(jié)果顯示，敲低前永生化鼻咽上皮細胞NP69、N5中RBM24 mRNA的表達量分別為4.73±0.56和7.01±0.78，顯著高于鼻咽癌細胞CNE1(1.00±0.06)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01，圖1A)。用RBM24 siRNA-1和siRNA-2轉(zhuǎn)染細胞后，CNE1細胞中RBM24 mRNA表達量分別為0.28±0.21和0.07±0.09，相比對照組(1.00±0.06)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01，圖1B)。同樣的，N5細胞的RBM24siRNA-1和siRNA-2轉(zhuǎn)染組中RBM24 mRNA表達量分別為0.13±0.07和0.09±0.01，相比對照組(1.00±0.11)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01，圖1C)。而在NP69細胞的siRNA-1和siRNA-2處理組中，RBM24 mRNA表達量分別為0.08±0.02和0.22±0.03，相比對照組(1.00±0.12)顯著降低，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01，圖1D)。上述結(jié)果提示RBM24敲低細胞模型構(gòu)建成功。由于siRNA-1與siRNA-2效果基本相同，后續(xù)實驗僅選用siRNA-1進行。

圖1 RBM24敲低對細胞中RBM24 mRNA表達量的影響

2.2 RBM24敲低對細胞增殖率的影響

采用CCK-8檢測RBM24敲低對細胞增殖率的影響，結(jié)果見表1。第3天和第4天時鼻咽癌CNE1細胞的RBM24敲低組增殖率(5.11±0.03)高于對照組(4.53±0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明，RBM24敲低可以顯著促進鼻咽癌細胞增殖。在永生化鼻咽上皮N5細胞中，第4天時RBM24敲低組細胞增殖率(2.09±0.18)亦高于對照組(1.73±0.12)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這表明，RBM24敲低可以促進N5細胞的增殖。但是，在另一株永生化鼻咽上皮細胞NP69中，RBM24敲低對細胞增殖的影響與N5并不相同，第4天時NP69細胞的RBM24敲低組細胞增殖率與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 RBM24敲低對細胞增殖率的影響

2.3 RBM24敲低后細胞中HOTAIR mRNA的表達

為確定RBM24與HOTAIR的關(guān)聯(lián)，采用qPCR分析RBM24敲低后HOTAIR mRNA的表達，結(jié)果見圖2。在CNE1細胞的RBM24敲低組中，HOTAIR mRNA表達量(67.54±1.87)相比對照組(1.00±0.21)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與CNE1細胞RBM24敲低組細胞增殖率顯著升高相吻合。N5細胞的RBM24敲低組中，HOTAIR mRNA表達量為7.81±1.90，相比對照組(1.00±0.19)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與N5的RBM24敲低組細胞增殖顯著加快相吻合。同樣的，在NP69的RBM24敲低組細胞中，HOTAIR mRNA表達量(1.31±0.15)與對照組(1.00±0.04)比較變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與NP69細胞中RBM24敲低組增殖變化不明顯相吻合。

上述實驗表明，RBM24敲低后，永生化鼻咽上皮細胞和鼻咽癌細胞的增殖變化情況，與HOTAIR mRNA表達增加情況相符。提示，RBM24敲低可能通過上調(diào)HOTAIR表達來促進細胞增殖。

圖2 RBM24敲低后對HOTAIR mRNA表達量的影響

3 討論

鼻咽癌早期癥狀不明顯，發(fā)病位置較為隱蔽，大多數(shù)鼻咽癌患者確診時已經(jīng)屬于晚期[15]。而晚期鼻咽癌患者生存率低下，III～IV期鼻咽癌患者的平均生存時間只有3年[15-16]，因此闡明鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的機制、尋找早期診斷的方法，對于鼻咽癌的預(yù)防與治療極為重要。目前關(guān)于RBM24在鼻咽癌中作用機制的研究非常少，本文主要圍繞RBM24敲低是否通過調(diào)控HOTAIR mRNA表達來影響鼻咽癌細胞的增殖進行研究。

過去，RBM24主要被認為通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯，調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和參與選擇性剪接等方式在胚胎干細胞分化[17]、心臟和肌肉發(fā)育[18-20]等過程中發(fā)揮作用。近年的研究表明，RBM24也是一種抑癌基因。Jiang等[21]發(fā)現(xiàn)RBM24可以通過結(jié)合p21轉(zhuǎn)錄本來促進p21表達，從而使p53缺失的腫瘤恢復(fù)正確的細胞周期。RBM24也可以結(jié)合到p63的3′端非編碼區(qū)，從而調(diào)控p63轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性[22]。本課題組前期研究[11]表明，RBM24在鼻咽癌組織中表達量顯著低于癌旁組織，在腫瘤中過表達RBM24可以抑制細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌細胞中進一步將RBM24敲低，可以使細胞增殖顯著增加，這說明RBM24進一步缺失會造成鼻咽癌細胞惡性程度增高。

除了鼻咽癌發(fā)展過程，RBM24在鼻咽癌的發(fā)生過程中也發(fā)揮一定的作用。正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化過程的相關(guān)研究比較少，機制尚不明確。永生化鼻咽上皮細胞是在正常鼻咽上皮細胞中轉(zhuǎn)入Bmi-1、SV40 large T antigen(SV40T)、HPV16E6/E7、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)等因子誘導(dǎo)永生化得到的細胞系，這類細胞仍然具有正常鼻咽上皮的特性[23-25]，適用于研究腫瘤發(fā)生的過程。體外培養(yǎng)的永生化鼻咽上皮細胞N5和NP69中RBM24表達量高于腫瘤細胞CNE1。與對照組相比，RBM24敲低后第4天N5細胞增殖加快，提示RBM24缺失可能在永生化鼻咽上皮細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用。

本研究進一步分析RBM24影響鼻咽癌細胞增殖的機制。HOTAIR是一種促癌因子，其不僅可以促進乳腺癌、卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[26-28]，也可以通過上調(diào)脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)來促進鼻咽癌發(fā)展與復(fù)發(fā)[12]。HOTAIR可以通過選擇性剪接產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本[29]。例如，HOTAIR的5′端具有多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)結(jié)合域，可以通過選擇性剪接去除該PRC2結(jié)合域[30-31]。HOTAIR能夠通過PRC2結(jié)合域招募并結(jié)合PRC2，從而抑制微小核糖核酸34(microRNA 34a，miR34a)表達，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[32]。HOTAIR還能夠通過3′端的賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)結(jié)合域發(fā)揮促癌作用[29]。由于RBM24具有RNA結(jié)合與選擇性剪接調(diào)控功能，我們推測，RBM24可能參與HOTAIR RNA選擇性剪接過程，調(diào)控不同轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。本研究表明，RBM24敲低可以促進永生化鼻咽上皮細胞N5和鼻咽癌細胞CNE1的細胞增殖，與之相符的，這些細胞中HOTAIR mRNA表達量升高。這提示，RBM24敲低后促進細胞增殖的作用可能與HOTAIR的表達上調(diào)相關(guān)，RBM24敲低后如果HOTAIR表達量上調(diào)，則可以促進細胞增殖(圖3)。但是永生化鼻咽上皮細胞NP69中HOTAIR表達量不變，細胞增殖也未發(fā)生顯著改變，提示可能有其他因素維持HOTAIR表達量穩(wěn)定，從而阻礙RBM24敲低對細胞增殖的促進作用(圖3)。此外，本研究使用的HOTAIR qPCR引物檢測的是HOTAIR轉(zhuǎn)錄本1和2的總表達量，并不能區(qū)分不同HOTAIR轉(zhuǎn)錄本的表達量。RBM24敲低對不同HOTAIR轉(zhuǎn)錄本表達量的影響，及其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚待解析。

圖3 RBM24通過調(diào)控HOTAIR表達來影響細胞增殖

腫瘤細胞與正常細胞相比，缺失了一些維持細胞正常特征的機制，而這類維持細胞正常特征的機制對于腫瘤的預(yù)防和治療有重要意義。雖然腫瘤細胞中RBM24缺失會進一步加快細胞增殖，但是在永生化鼻咽上皮細胞N5和NP69中敲低RBM24后，前者HOTAIR表達量顯著上升，細胞增殖加快，而后者HOTAIR表達量與細胞增殖變化都不明顯。提示可能有其他機制在RBM24缺失后能夠繼續(xù)維持NP69細胞的HOTAIR表達量和細胞增殖的穩(wěn)定。比較N5和NP69細胞的差異可知，N5細胞是在正常鼻咽上皮細胞中轉(zhuǎn)入TERT誘導(dǎo)得到的永生化鼻咽上皮細胞系(類似于NP460hTert細胞[25])，而NP69細胞是轉(zhuǎn)入SV40T誘導(dǎo)得到的永生化細胞系[23]。由于誘導(dǎo)方式的差異，兩種永生化鼻咽上皮細胞系的基因表達差異和信號通路差異可能是造成RBM24敲低后HOTAIR和細胞增殖變化不同的原因。但是，目前尚缺少SV40T與TERT兩種誘導(dǎo)方式影響HOTAIR的報道，也缺少RBM24調(diào)控HOTAIR的機制研究?？赡茉谡１茄噬掀ぜ毎羞^表達SV40T與TERT后，兩種因子分別激活不同的信號通路來實現(xiàn)細胞永生化，因此細胞的基因表達也不一樣。相較于N5細胞，NP69細胞中可能存在某種因子(蛋白或非編碼RNA等)的高表達，而這種因子可以阻斷RBM24-HOTAIR信號通路；NP69也可能缺失某種因子，而這種因子是RBM24-HOTAIR通路所必需的。進一步比較N5和NP69細胞之間的蛋白和非編碼RNA的表達差異，分析RBM24調(diào)控HOTAIR的通路，有助于解析正常細胞中維持HOTAIR和細胞增殖穩(wěn)定性的機制，這對于闡明正常細胞癌變過程的機制有重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞CNE1和永生化鼻咽上皮細胞N5中，RBM24表達量降低可以顯著促進HOTAIR的升高，從而促進鼻咽癌細胞增殖。提示RBM24和HOTAIR有望成為鼻咽癌預(yù)防和治療的靶位點。然而，RBM24表達量降低后，永生化鼻咽上皮細胞NP69中HOTAIR mRNA表達和細胞增殖的變化不明顯，可能有其他機制參與維持HOTAIR表達量和細胞增殖穩(wěn)定性，相關(guān)機制有待進一步研究。