薄秀梅，賀 玲，張榮麗，杜賽君，徐 洲

抑郁癥是以情緒低落、精神萎靡和自主活動減少為臨床特征的一類精神疾病。目前傳統(tǒng)的抗抑郁藥雖有一定療效，但副作用較大，如導(dǎo)致性功能障礙、降低血壓、增加體質(zhì)量等[1]。因此，從植物中尋找高效、低毒的天然抗抑郁活性成分成為治療抑郁癥的研究熱點。動物體內(nèi)注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可誘發(fā)類似抑郁的行為，常作為研究炎癥誘導(dǎo)抑郁癥的模型[2]。C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路成為抑郁癥研究和治療的新靶標(biāo)[3]，在神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、大腦缺血等胞外信號刺激下，JNK被激活，作用于下游底物c-Jun等，引起促凋亡蛋白的活化。在抑郁模型動物中，Caspase-3、Bax表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)降低，最終通過線粒體凋亡途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡[4-5]。

姜黃素(curcumin，CUR)的分子式為C21H20O6，最早是從姜黃中分離出來的多酚類化合物。研究[6]表明，姜黃素具有抗炎抗氧化等多種功效，可以減少在強迫游泳和懸尾實驗中的不動時間，還可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]。關(guān)于姜黃素對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為的影響及相應(yīng)機制未見報道。該研究采用腹腔注射LPS制作小鼠抑郁模型，觀察姜黃素對小鼠抑郁行為的改善作用，并進一步探索其是否通過降低JNK磷酸化及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性健康ICR小鼠30只，體質(zhì)量15～20 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證編號：SYXK(蘇)2015-0030。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20 ～ 25 ℃，期間自由飲食飲水。

1.1.2主要試劑藥品 姜黃素(純度98%)購自鄭州荔諾生物科技有限公司；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)、JNK、p-JNK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspartic acid protease-3, Caspase-3)多克隆抗體，兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；Western blot相關(guān)試劑盒購自上海碧云天公司；尼氏染色液購自北京索萊寶科技有限公司；LPS、熒光二抗購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1模型制作和給藥方法 腹腔注射LPS(1 mg/kg)制作小鼠抑郁模型。選取30只小鼠隨機分為Control組(對照組)、LPS組(模型組)和CUR組，每組10只。CUR組小鼠每日灌胃給予姜黃素40 mg/kg，Control組給予等劑量生理鹽水。5周后，LPS組、CUR組小鼠單次腹腔注射LPS、Control組給予等劑量生理鹽水，24 h后進行行為學(xué)測試及蛋白表達(dá)檢測。

1.2.2糖水偏好實驗 糖水偏好度是評估動物抑郁行為的重要指標(biāo)之一，參照文獻[8]對小鼠進行糖水/純水消耗實驗。小鼠單籠飼養(yǎng)，在LPS或生理鹽水注射前，稱量好清水瓶與糖水瓶(1%蔗糖溶液)的初始重量，24 h后再次稱量，并計算實驗前后小鼠清水和糖水消耗量，糖水偏好度計算公式：糖水偏好度(%)=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.2.3曠場實驗 曠場實驗在黑色塑料敞箱中進行，實驗時每次將一只小鼠放入敞箱的正中央，應(yīng)用Anaze Y軟件記錄10 min內(nèi)小鼠的運動距離和穿越中心格的次數(shù)。

1.2.4強迫游泳實驗 將小鼠放入高30 cm，直徑11 cm，水深15 cm的圓形透明游泳桶中，桶內(nèi)水溫 (25±1) ℃，每只小鼠預(yù)游泳2 min以適應(yīng)環(huán)境。用ZH-QPT系統(tǒng)觀察并記錄其行為學(xué)指標(biāo)5 min，用Any-maze system軟件記錄其靜止不動的時間。

1.2.5尼氏染色實驗 取小鼠大腦PFC區(qū)，進行石蠟包埋，經(jīng)切片(5 μm)、漂片、貼片、烘片后，二甲苯脫蠟，用0.1%尼式染色液在 37 ℃ 環(huán)境下染色50 min，染色結(jié)束后經(jīng)洗滌、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞受損情況，同時每張切片取6個視野計算1 mm2神經(jīng)細(xì)胞存活個數(shù)，取平均值。

1.2.6蛋白免疫印跡實驗 取小鼠大腦PFC區(qū)，根據(jù)試劑盒說明書提取總蛋白，取50 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳(110 V，200 min)、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加一抗4 ℃過夜，洗膜后，加相應(yīng)二抗25 ℃避光孵育2 h，洗膜后掃描并拍照，應(yīng)用軟件Image J分析蛋白灰度值，將目的蛋白與非磷酸化蛋白或β-actin灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對抑郁小鼠糖水消耗的影響與Control組(61.30±2.05)相比，LPS組(44.10±3.92)小鼠糖水偏好度降低(P<0.05)；與LPS組相比，CUR組(58.67±1.82)糖水偏好度升高，接近對照水平(P<0.05)。

2.2 姜黃素對抑郁小鼠運動距離和穿格次數(shù)的影響LPS組小鼠出現(xiàn)抑郁癥狀，表現(xiàn)為情緒低落，活動量減少，探索能力下降。而給予姜黃素后上述癥狀得到改善。統(tǒng)計分析顯示，與Control組相比，LPS組小鼠活動總距離縮短，穿越中心格次數(shù)減少(P<0.05)；與LPS組相比，CUR組小鼠運動距離明顯增加，穿越中心格次數(shù)增加(P<0.05)。見表1。

2.3 姜黃素對抑郁小鼠強迫游泳中不動時間的影響與Control組相比，LPS組小鼠不動時間延長(P<0.05)；與LPS組相比，CUR組小鼠不動時間縮短(P<0.05)，見表1。

表1 姜黃素對抑郁模型小鼠行為學(xué)的影響

與Control組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

2.4 姜黃素對抑郁小鼠PFC區(qū)神經(jīng)元的影響尼式體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，廣泛存在于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi)，與堿性染料結(jié)合，顯示出藍(lán)紫色，能反映細(xì)胞的存活狀態(tài)。Control組神經(jīng)細(xì)胞胞體形態(tài)正常，排列均勻，胞質(zhì)透明，未見神經(jīng)元損傷。LPS組大部分細(xì)胞分布稀疏，胞核固縮，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，而CUR組只有少部分細(xì)胞損傷。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，與Control組比較，LPS組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。與LPS組比較，CUR組小鼠神經(jīng)元損傷減輕，細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05)。見圖1。

2.5 姜黃素對抑郁小鼠p-JNK/JNK的影響對Western blot結(jié)果進行分析，計算各組p-JNK與JNK比值，并以Control組為基數(shù)1.00，計算LPS組和CUR組與Control組的相對比值。與Control組比較，LPS組JNK磷酸化水平升高，p-JNK/JNK增加(3.01)(P<0.05)；與LPS組比較，CUR組JNK磷酸化水平降低，p-JNK/JNK降低(1.86)(P<0.05)。見圖2。

2.6 姜黃素對抑郁小鼠凋亡蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果條帶分析表明，與Control組相比，LPS組Bcl-2蛋白表達(dá)降低而Bax、Caspase-3水平升高(P<0.05);CUR組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax、Caspase-3水平降低(P<0.05)。見圖3。

圖1 姜黃素對抑郁小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響 ×200

圖2 姜黃素對抑郁小鼠JNK磷酸化水平的影響

3 討論

動物體內(nèi)腹腔注射LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生抑郁癥，屬于急性應(yīng)激抑郁模型，且較低劑量更容易引發(fā)炎癥反應(yīng)，在曠場實驗及暗場實驗中出現(xiàn)自主活動減少等癥狀[9]，該研究利用單次腹腔注射1.00 mg/kg LPS制作小鼠抑郁模型。結(jié)果顯示，模型組小鼠表現(xiàn)出臨床相似抑郁癥狀，行為學(xué)測試表現(xiàn)為：SPT中糖水偏好度降低；OFT中自主活動減少，運動距離變短，穿格次數(shù)減少；FST中靜止不動時間延長，快感降低等，表明模型制作成功，上述抑郁癥狀在姜黃素預(yù)防性給藥的小鼠中明顯得到改善。PFC區(qū)是導(dǎo)致心境障礙的大腦區(qū)域之一，其功能變化在抑郁癥發(fā)病過程中扮演重要角色[5]。神經(jīng)元內(nèi)尼氏體的密度與神經(jīng)元損傷程度密切相關(guān)，是評價神經(jīng)元損傷程度的重要指標(biāo)。該研究對PFC區(qū)組織形態(tài)學(xué)的改變進行了評估，結(jié)果表明，模型組小鼠的PFC區(qū)神經(jīng)細(xì)胞松散，排列不規(guī)則，細(xì)胞固縮，尼氏體減少。而提前給予姜黃素治療CUR組，神經(jīng)元受損狀況得到改善，提示姜黃素可以抑制PFC區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，從而保護神經(jīng)細(xì)胞。

圖3 姜黃素對抑郁小鼠凋亡蛋白表達(dá)的影響

研究[10]表明LPS刺激可提高小鼠PFC區(qū)的JNK磷酸化水平，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥發(fā)生。JNK被激活后，p-JNK升高，同時降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax的水平，并進一步促進線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)，與凋亡酶激活因子-1相互作用，通過ATP的協(xié)助組成凋亡復(fù)合體，此復(fù)合體迅速結(jié)合并激活Pro-Caspase-9，產(chǎn)生Caspase-9全酶，導(dǎo)致Caspase-3的表達(dá)明顯升高，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，通過線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示LPS組小鼠p-JNK表達(dá)量顯著升高，提前灌胃給予姜黃素可降低p-JNK的水平，提示姜黃素的抗抑郁作用可能與抑制JNK的磷酸化有關(guān)，由于JNK的激活受到抑制，某些基因表達(dá)或者新生蛋白質(zhì)的合成受阻，相關(guān)凋亡途徑被中斷；進一步研究表明LPS組Bax、Caspase-3表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)降低，而給予姜黃素后可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。這些研究結(jié)果提示，抑郁癥的發(fā)生與JNK磷酸化的程度有關(guān)，這一觀點與之前的研究結(jié)果一致，JNK激活后誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是抑郁癥發(fā)病原因之一，而姜黃素正是通過抑制p-JNK、降低促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)，提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，從而阻止神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抗抑郁效果。

姜黃是亞洲國家的常用食物，對人體健康有積極的作用，同時作為藥物，在印度和中國治療感染、抑郁癥等疾病使用了幾個世紀(jì)[11]。在大鼠抑郁癥模型中，使用姜黃素進行實驗性飲食治療，抑制了抑郁大鼠海馬萎縮，提高了神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平，同時降低了Caspase-3的表達(dá)使抑郁癥得到改善[12-13]。Meta分析表明長期補充姜黃素可能會改善患者的抑郁和焦慮癥狀，因此有學(xué)者建議將姜黃素作為飲食治療[14- 15]。該研究采用的提前灌胃給予姜黃素屬于實驗性飲食治療范疇，接近人們?nèi)粘Ｊ褂媒S的生活習(xí)慣，使模型更具說服力。

綜上所述，LPS通過激活JNK誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抑郁行為，姜黃素減輕小鼠的抑郁行為可能與降低JNK磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活有關(guān)。本實驗部分揭示了姜黃素的抗抑郁作用及機制，為尋找抗抑郁藥提供了新的思路和實驗基礎(chǔ)。