嚴(yán)榮榮，管世鶴，楊 凱，張 浩，汪玲妹，李 姣

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，也是我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。手術(shù)切除是HCC主要的治療方式，但HCC起病隱匿，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)即為中晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)；且HCC易復(fù)發(fā)，術(shù)后5年生存率低，預(yù)后較差[2]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是現(xiàn)今臨床上診斷HCC最常用的血清學(xué)標(biāo)志物，但有約30%的HCC患者血清AFP檢測(cè)結(jié)果為陰性，且在早期和較小腫瘤(≤2 cm)中AFP診斷效能亦不理想[3]。因此，尋找對(duì)HCC敏感且特異性高的篩查指標(biāo)，對(duì)慢性肝病患者進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)、早期干預(yù)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。

絲氨酸蛋白酶抑制劑kazal1型(serine peptidase inhibitor Kazal type1，SPINK1)又稱為腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制劑(TATI)或胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(PSTI)，是一種分泌性多肽。在正常機(jī)體中的主要功能是抑制胰蛋白酶原的過早激活[4]。有研究[5]顯示，SPINK1具有生長(zhǎng)因子和凋亡抑制劑的功能，在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。目前，血清SPINK1已被發(fā)現(xiàn)可用于前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤的診斷及預(yù)后評(píng)估[6]，但其在HCC的診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)中的作用尚不明確。該研究旨在分析SPINK1單獨(dú)及聯(lián)合AFP檢測(cè)對(duì)HCC的診斷效能，同時(shí)探討SPINK1對(duì)HCC短期預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年1月～2018年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的住院患者或健康體檢者血清及臨床資料，分為3組進(jìn)行研究：① 慢性肝病組患者73例，男54例，女19例，年齡17～78(43.75±15.87)歲；② HCC組患者87例，男77例，女10例，年齡為31～74(56.56±11.68)歲。③ 健康對(duì)照組志愿者45例，男25例，女20例，年齡24～75(37.00±9.22)歲。慢性肝病組患者符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)(中國(guó)肝病學(xué)會(huì)和中國(guó)傳染病學(xué)會(huì))制定的標(biāo)準(zhǔn)6》[7]，排除合并肝硬化或其他類型肝炎的病例；HCC組患者符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部制定的原發(fā)性肝癌診斷和治療標(biāo)準(zhǔn)(2012)》[8]。健康志愿者的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及腹部B超均正常。三組研究對(duì)象在性別、年齡組成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 SPINK1的檢測(cè)收集研究對(duì)象治療前空腹全血，采集后1 h內(nèi)室溫離心(3 500 r/min，10 min)制備高質(zhì)量血清，并于-70 ℃下凍存。采用ELISA法檢測(cè)血清中的SPINK1，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，產(chǎn)品批號(hào)DY 7496/DY 008，酶標(biāo)儀KHB ST-360購(gòu)自上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司。

1.3 AFP及肝功能指標(biāo)的檢測(cè)應(yīng)用羅氏Cobas E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏診斷公司)檢測(cè)血清AFP，西門子Dimension EXLTMwith LM全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門子診斷公司)檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 SPINK1等血清學(xué)指標(biāo)水平在各組中比較HCC組和慢性肝病組血清ALT、AST、DBIL、AFP和SPINK1水平較健康對(duì)照組均升高(P<0.05)。HCC組SPINK1及AFP水平與慢性肝病組及健康對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=87.28、72.55，P<0.01)，慢性肝病組SPINK1水平與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.27，P=0.07)。見表1。

表1 3組患者的血清學(xué)指標(biāo)比較[M(P25～P75)]

2.2 血清SPINK1與AFP對(duì)肝癌的診斷效能比較以非HCC組(健康對(duì)照組和慢性肝病組)或慢性肝病組為對(duì)照組繪制ROC曲線，均SPINK1診斷敏感度高于AFP，兩指標(biāo)曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.234、0.739，P>0. 05)。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，均ROC曲線下面積高于SPINK1與AFP單獨(dú)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.543、2.262，P<0.05和Z=2.217、2.444，P<0.05)。以非HCC組(健康對(duì)照組和慢性肝病組)為對(duì)照組，AFP陰性(AFP≤20 ng/ml)HCC組為病例組，SPINK1的 ROC曲線下面積為81.70%(95%CI：0.74～0.88，P<0.01)，取cut-off值為1.75 ng/ml時(shí)，特異度為71.18%，敏感度為95%。見圖1及表2、3。

圖1 應(yīng)用ROC曲線分析血清SPINK1在HCC中的診斷價(jià)值

表2 血清SPINK1、AFP單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷效能比較(以慢性肝病組為對(duì)照)

表3 血清SPINK1、AFP單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)HCC診斷效能比較(以健康對(duì)照組和慢性肝病組為對(duì)照)

2.3 血清SPINK1、AFP與HCC肝功能Child-Pugh分級(jí)的關(guān)系不同Child-Pugh分級(jí)HCC患者組間血清SPINK1、AFP水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.82、10.17，P<0.01)。Grade C級(jí)患者血清SPINK1、AFP水平高于Grade A級(jí)患者(Z=2.91、4.95，P<0.01)。Grade B級(jí)患者血清SPINK1、AFP水平高于Grade A級(jí)患者(Z=2.36、3.02，P<0.05)。 Grade C級(jí)患者血清SPINK1、AFP水平高于Grade B級(jí)患者(Z=2.43、2.17，P<0.05)。見表4。

表4 不同 Child-Pugh 分級(jí)HCC患者血清 AFP、SPINK1指標(biāo)比較

2.4 HCC患者DFS預(yù)測(cè)因素分析HCC患者均進(jìn)行至少12個(gè)月隨訪，統(tǒng)計(jì)患者無病生存期(disease free survival，DFS)?；颊咧形簧鏁r(shí)間為8個(gè)月，1年總生存率為38.1%。 Kaplan-Meier分析顯示，SPINK1高表達(dá)組DFS低于SPINK1低表達(dá)組(P=0.001)，見圖2。Kaplan-Meier單因素生存分析提示血清SPINK1水平、血清AFP水平、腫瘤大小、Child-Pugh 分級(jí)對(duì)患者DFS均具有預(yù)測(cè)價(jià)值；多因素分析發(fā)現(xiàn)，血清SPINK1(HR=9.92，P<0.001)，AFP(HR=2.41，P<0.05)，腫瘤大小(HR=1.94，P<0.05)及Child-Pugh C級(jí)(HR=3.27，95%CI：1.15～9.26，P<0.05)均為HCC患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表5。

表5 HCC預(yù)后的單因素及多因素分析

圖2 SPINK1表達(dá)水平與HCC患者DFS的關(guān)系

3 討論

我國(guó)HCC發(fā)病率占全球50%左右，由于早期不易診斷，且治療后易復(fù)發(fā)，其總體預(yù)后不佳[2]。AFP作為HCC的常用篩查指標(biāo)，其診斷效能欠佳。SPINK1是一種新的腫瘤標(biāo)志物，在多種腫瘤中均有表達(dá)[6]。本研究中，HCC組的血清SPINK1水平較健康對(duì)照組和慢性肝病組升高(P<0.05)，但慢性肝病組與健康對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)，表明血清SPINK1能較好的鑒別良性肝病與HCC。經(jīng)ROC曲線分析，血清SPINK1與AFP單獨(dú)診斷HCC的ROC曲線下面積(0.879vs0.845)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者鑒別HCC的能力相仿，面積大于0.8表明其診斷價(jià)值較高。與現(xiàn)有報(bào)道[9-10]相符。血清SPINK1與AFP聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高診斷特異度(97.48%)，有利于增強(qiáng)臨床工作中對(duì)HCC的準(zhǔn)確識(shí)別。血清SPINK1對(duì)AFP陰性的HCC也有補(bǔ)充診斷作用。以AFP陰性的HCC為病例組，當(dāng)SPINK1 cut-off值取1.75 ng/ml時(shí)，其敏感度可高達(dá)95%。因此，定期篩查血清SPINK1可大大提高HCC的診斷率，具有較高的臨床價(jià)值。

既往研究[5-6]表明，腫瘤患者體內(nèi)SPINK1異常表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究中HCC患者血清SPINK1含量與Child-Pugh分級(jí)變化趨勢(shì)基本一致(P<0.05)，提示動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清SPINK1有助于正確評(píng)估HCC患者疾病情況，該結(jié)果與文獻(xiàn)[5,10]報(bào)道相符合。COX回歸分析表明，SPINK1是HCC患者短期DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。此外，AFP水平升高、腫瘤體積較大、更高的Child-Pugh分級(jí)也影響HCC短期DFS，與既往報(bào)道[11-12]結(jié)果相符。因而，血清SPINK1作為HCC患者預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)，對(duì)HCC的短期預(yù)后分層具有重要指導(dǎo)意義。

目前研究表明血清SPINK1是HCC良好的診斷和預(yù)后評(píng)判指標(biāo)，然而其在HCC進(jìn)程中扮演的角色尚不明確。有文獻(xiàn)[5-6,13]報(bào)道，SPINK1與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)具有結(jié)構(gòu)相似性，在腫瘤微環(huán)境中可通過EGFR信號(hào)途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，我國(guó)HCC的發(fā)生主要是由于乙型肝炎病毒(HBV)感染引起肝臟慢性炎癥反復(fù)發(fā)作所致。Hass et al[10]研究表明SPINK1可通過干擾病毒感染肝細(xì)胞的凋亡而間接促進(jìn)病毒的增殖。而Zhu et al[9]報(bào)道HBV可通過X蛋白增強(qiáng)肝癌細(xì)胞中SPINK1的表達(dá)。據(jù)此推測(cè)SPINK1可能通過與HBV相互作用促進(jìn)HCC的發(fā)生及進(jìn)展，然而其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

綜上，血清SPINK1對(duì)HCC有較高的診斷價(jià)值，在AFP陰性HCC的診斷中亦具有重要補(bǔ)充診斷意義。高水平SPINK1提示HCC的短期預(yù)后不良，可作為HCC預(yù)后分層的一個(gè)潛在血清標(biāo)志物。