夏盛隆 金穎莉 吳利敏 盧光榮 鐘金偉 全多多 鄭 波&

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院消化內(nèi)科1(325000) 病理科2

背景：Th17/Treg細(xì)胞失衡可能是參與克羅恩病(CD)發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)信號通路是影響包括CD在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的潛在機制之一。目的：探討TRAIL基因敲除對實驗性結(jié)腸炎小鼠Th17/Treg細(xì)胞平衡的影響。方法：采用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)獲得TRAIL-/- C57BL/6小鼠。分別將TRAIL-/-小鼠和同品系野生型(WT)小鼠各20只隨機分為兩組，一組不予處理，一組以三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)實驗性結(jié)腸炎。評估各組小鼠結(jié)腸炎癥程度，采用real-time PCR、蛋白質(zhì)印跡法和ELISA法檢測外周血和結(jié)腸組織中的Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3和細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(IL-17)、IL-10表達。結(jié)果：與未造模小鼠相比，造模小鼠體質(zhì)量顯著下降，結(jié)腸縮短，疾病活動指數(shù)評分和組織活動度指數(shù)評分升高(P<0.05)，TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠上述表現(xiàn)更為明顯(P<0.05)。WT結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸組織中的RORγt、IL-17表達較未造模WT小鼠顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)oxp3、IL-10表達顯著降低(P<0.05)。TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠上述Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)因子表達和RORγt/Foxp3比值均較WT結(jié)腸炎小鼠顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：TRAIL基因敲除可能通過Th17/Treg細(xì)胞比例上調(diào)加重實驗性結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥反應(yīng)。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族，其與死亡受體(death receptors,DRs；人DR4、DR5，小鼠TRAIL-R)構(gòu)成的信號通路能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，對正常細(xì)胞則幾乎無凋亡誘導(dǎo)作用[1]。最新研究顯示，TRAIL及其DRs廣泛表達于T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞，在多種免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等多種自身免疫性疾病密切相關(guān)[1-4]。Ikeda等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型(wide-type,WT)小鼠相比，TRAIL-/-小鼠的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)生更早，病情更重，其機制可能與TRAIL能抑制Th1細(xì)胞，同時增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg細(xì)胞)有關(guān)。另有研究[6]表明，TRAIL/DR5信號通路在Treg細(xì)胞抑制并殺傷效應(yīng)T細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，是Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的機制之一。

克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是一種累及全消化道的慢性非干酪性肉芽腫性疾病，其確切病因和發(fā)病機制至今不明。過去認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞極化異常是CD發(fā)病的主要原因，但近年研究顯示，對于包括CD在內(nèi)的多種自身免疫性疾病而言，Th17/Treg細(xì)胞失衡可能比Th1/Th2細(xì)胞極化異常更為重要。研究[7]發(fā)現(xiàn)CD患者外周血中Th17細(xì)胞增多、Treg細(xì)胞減少，Th17/Treg細(xì)胞比例升高，并與疾病活動度和高復(fù)發(fā)風(fēng)險密切相關(guān)，但導(dǎo)致CD中Th17/Treg細(xì)胞失衡的確切機制至今仍未闡明。本研究在TRAIL-/-小鼠中以三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)實驗性結(jié)腸炎，探討TRAIL基因敲除是否會影響模型小鼠外周血和結(jié)腸組織中的Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量，進而影響腸道炎癥反應(yīng)，以期有助于揭示TRAIL信號通路影響CD的潛在機制，為以TRAIL為靶點的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

1.實驗動物：采用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)獲得TRAIL-/-C57BL/6小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司)，PCR驗證TRAIL-/-小鼠基因型(圖1)。同品系WT小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。研究獲溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(wydw2016-0215)。

2.主要試劑：TNBS(Sigma-Aldrich LLC.)；TRIzol試劑(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific)；PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara Bio Inc.)；iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix(Bio-Rad Laborat-ories,Inc.)；RORγt、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、Foxp3、IL-10抗體(Abcam plc.)；GAPDH抗體(Affinity Bioscience)；RORγt、IL-17、Foxp3、IL-10 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物)。

二、方法

1.動物分組和結(jié)腸炎模型制備：6～8周齡、體質(zhì)量20～22 g的雄性TRAIL-/-小鼠和WT小鼠各20只分別以隨機數(shù)字表法分為兩組，每組10只，一組不予處理，一組以TNBS誘導(dǎo)實驗性結(jié)腸炎。造模前小鼠禁食、不禁水24 h。將5% TNBS與無水乙醇等體積混合，配制成2.5%的溶液，根據(jù)小鼠體質(zhì)量按250 mg/kg灌腸1次[8]。灌腸前協(xié)助小鼠充分排出腸道內(nèi)糞便，1.0%戊巴比妥(0.2 mL)腹腔注射麻醉。將經(jīng)石蠟油潤滑的直徑約2 mm的硅膠管由肛門輕緩插入腸道約4 cm，緩慢注入TNBS-乙醇溶液，將小鼠倒立靜置約30 s；緩慢抽出硅膠管，捏住肛門繼續(xù)倒置約1 min后將小鼠放回鼠籠中，待麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。

2.結(jié)腸炎癥程度評估：每日觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、進食和活動情況、體質(zhì)量變化、糞便性狀和次數(shù)，行疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分[9]。造模第4天以頸椎脫臼法處死小鼠，眼眶靜脈叢取血，置于EDTA抗凝管中，并收集炎癥表現(xiàn)明顯的結(jié)腸組織備用。部分結(jié)腸組織常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下評估組織活動度指數(shù)(histology activity index,HAI)[9]。

3.Real-time PCR：提取小鼠外周血和結(jié)腸組織總RNA，分光光度計檢測RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行real-time PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green 10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列

4.蛋白質(zhì)印跡法：蛋白質(zhì)裂解液提取結(jié)腸組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品在10%凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，將PVDF膜放入一抗(RORγt、IL-17、Foxp3、IL-10或GAPDH)，4 ℃搖床孵育過夜，洗滌后二抗室溫孵育1 h，顯影，Image Lab軟件分析目的蛋白相對表達量。

5.ELISA：取小鼠外周血，離心(3 000 r/min,15 min)后吸取上層血漿，參照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測血漿IL-17、IL-10濃度。剩余部分加入PBS等比稀釋混勻，加入等體積Ficoll分離液，離心(2 200 r/min,40 min,20 ℃慢升慢降)，取云霧狀外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，經(jīng)勻漿器充分勻漿后低速離心，取上清液，參照說明書檢測RORγt、Foxp3濃度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、TRAIL基因敲除對小鼠結(jié)腸炎的影響

WT小鼠經(jīng)TNBS灌腸后逐漸出現(xiàn)厭食、懶動、體質(zhì)量減輕、糞便不成形或稀便，部分出現(xiàn)血便，癥狀隨時間延長而加重；TRAIL-/-小鼠造模后出現(xiàn)蜷縮、懶動，肛門處有黑便黏附，并有血便，體質(zhì)量明顯減輕。結(jié)腸組織HE染色顯示結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜中有大量炎性細(xì)胞浸潤，可見黏膜缺損和潰瘍面形成，黏膜充血水腫明顯。與WT結(jié)腸炎小鼠相比，TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量下降更為顯著，結(jié)腸明顯縮短，DAI和HAI評分明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖2)。造模第4天，WT小鼠有2只死亡，TRAIL-/-小鼠有3只死亡。

未造模的WT和TRAIL-/-小鼠整個實驗過程中體質(zhì)量輕度增加，無自發(fā)性腹瀉、便血等結(jié)腸炎癥狀，光學(xué)顯微鏡下未見結(jié)腸組織中有明顯炎性細(xì)胞浸潤和組織損傷(圖2)。

A:***與WT結(jié)腸炎小鼠比較，P<0.001;C、E、F:兩組間比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001A：體質(zhì)量變化；B：腸道大體形態(tài)(從左至右依次為TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠、WT結(jié)腸炎小鼠、TRAIL-/-小鼠、WT小鼠)；C：結(jié)腸長度比較；D：結(jié)腸組織病理學(xué)變化(左上：WT小鼠；左下：TRAIL-/-小鼠；右上：WT結(jié)腸炎小鼠；右下：TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠；HE染色，×200)；E：DAI評分；F：HAI評分圖2 TRAIL基因敲除對小鼠結(jié)腸炎的影響

二、TRAIL基因敲除對Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的影響

Real-time PCR檢測顯示，與未造模WT小鼠相比，WT結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸組織中的RORγt、IL-17 mRNA表達升高，F(xiàn)oxp3、IL-10 mRNA表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與WT結(jié)腸炎小鼠相比，TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸組織中的RORγt、IL-17、Foxp3、IL-10 mRNA表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；未造模WT小鼠與TRAIL-/-小鼠間外周血和結(jié)腸組織中上述基因mRNA表達均無明顯差異(P>0.05；圖3)。進一步采用ELISA法和蛋白質(zhì)印跡法在外周血和結(jié)腸組織中驗證上述基因蛋白表達，結(jié)果顯示四組間蛋白表達變化與mRNA表達變化相一致(圖4)。

圖3 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織RORγt、IL-17、Foxp3、IL-10 mRNA表達比較

圖4 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織RORγt、IL-17、Foxp3、IL-10蛋白表達比較

在此基礎(chǔ)上采用RORγt/Foxp3 mRNA比值反映Th17與Treg細(xì)胞之間的比例關(guān)系，結(jié)果顯示W(wǎng)T結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸組織中的RORγt/Foxp3比值較未造模WT小鼠明顯升高，TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠的RORγt/Foxp3比值較WT結(jié)腸炎小鼠進一步升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖5)。

圖5 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織RORγt/Foxp3比值比較

討 論

大量研究表明，腸黏膜免疫異常激活參與了CD的發(fā)生、發(fā)展。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，CD患者的腸黏膜炎癥以分泌干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α的Th1型免疫反應(yīng)為主，但近年研究發(fā)現(xiàn)Th17和Treg細(xì)胞在CD中可能起較Th1細(xì)胞更為重要的作用。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-23等促炎細(xì)胞因子，通過增強靶細(xì)胞通透性、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞募集和活化，最終促進炎癥發(fā)生，RORγt是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Treg細(xì)胞作為一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過分泌IL-10等抗炎細(xì)胞因子直接或間接抑制過度激活的免疫應(yīng)答，緩解腸道炎癥，其特征性標(biāo)志為高表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。研究顯示Th17/Treg細(xì)胞失衡可能是參與CD發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要環(huán)節(jié)，恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞平衡能明顯緩解腸道炎癥反應(yīng)[7-8,10-11]，本研究結(jié)果支持上述結(jié)論。目前認(rèn)為TNBS-乙醇溶液誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動物模型與人類CD的炎癥模式類似，乙醇破壞腸黏膜屏障，使TNBS與腸道組織中的大分子蛋白共價結(jié)合形成自身完全抗原，激發(fā)以Th1、Th17細(xì)胞免疫為主的局部免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)針對自身抗原的腸道遲發(fā)性超敏反應(yīng)，最終導(dǎo)致類似CD的腸道炎癥[12]。本研究中WT小鼠經(jīng)TNBS-乙醇灌腸誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，外周血和結(jié)腸組織中的Th17細(xì)胞數(shù)量增加，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，Th17/Treg細(xì)胞比例升高。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，TRAIL-/-小鼠造模后不僅更早出現(xiàn)結(jié)腸炎癥狀，病情亦更重，死亡數(shù)更多，與利用TRAIL-/-小鼠研究其他自身免疫性疾病的研究結(jié)果基本一致，如EAE、1型糖尿病和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[5,13-14]，提示TRAIL信號通路是影響包括CD在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的潛在機制之一。Zhu等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，TRAIL-R-/-小鼠對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎更易感，TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中存在JNK和NF-κB過度激活。另有一項對炎癥性腸病(IBD)患者的研究[16]顯示，TRAIL在炎性黏膜腸上皮細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞中表達上調(diào)，體外機制研究表明TRAIL在維持腸上皮屏障穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在炎癥情況下能促進腸上皮細(xì)胞凋亡。上述發(fā)現(xiàn)提示TRAIL信號可能具有強力抗炎活性，通過調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡對結(jié)腸損傷發(fā)揮保護作用。

在發(fā)現(xiàn)TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥重于WT結(jié)腸炎小鼠的基礎(chǔ)上，本研究進一步比較了兩組小鼠的免疫學(xué)特征，結(jié)果顯示盡管TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸組織中的Th17細(xì)胞相關(guān)因子(RORγt、IL-17)和Treg細(xì)胞相關(guān)因子(Foxp3、IL-10)表達與WT結(jié)腸炎小鼠相比均明顯上調(diào)，但反映Th17與Treg細(xì)胞比例的RORγt/Foxp3比值顯著高于WT結(jié)腸炎小鼠，表明Th17細(xì)胞數(shù)量增加遠(yuǎn)多于Treg細(xì)胞。目前研究證實TRAIL介導(dǎo)的凋亡信號是調(diào)控免疫細(xì)胞凋亡的重要機制之一，而且不同CD4+T細(xì)胞亞群對TRAIL凋亡信號的敏感性可能存在差異，Th1細(xì)胞對之敏感，Th2細(xì)胞則存在抵抗[17]。由此推測，在TRAIL基因敲除小鼠中誘導(dǎo)實驗性結(jié)腸炎，其體內(nèi)Th17和Treg細(xì)胞凋亡均較WT結(jié)腸炎小鼠減少，但與發(fā)揮抗炎作用的Treg細(xì)胞相比，Th17細(xì)胞凋亡受抑更為顯著，細(xì)胞數(shù)量異常增加，Th17/Treg細(xì)胞平衡被打破，最終導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生。

Zhu等[15]對DSS結(jié)腸炎模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與WT結(jié)腸炎小鼠相比，TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠腸黏膜中CD3+T細(xì)胞數(shù)量增加，而Treg細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。在小鼠EAE模型中，TRAIL-/-小鼠脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中的Treg細(xì)胞數(shù)量較WT小鼠顯著減少，Th17細(xì)胞數(shù)量則無明顯變化[5]。Park等[18]的研究采用TRAIL-R激動劑聚乙二醇化TRAIL(TRAILPEG)治療小鼠實驗性關(guān)節(jié)炎，發(fā)現(xiàn)其不僅能誘導(dǎo)caspase-3、caspase-7活性增加、促進炎性關(guān)節(jié)組織中的Th17細(xì)胞凋亡，還能直接促進Treg細(xì)胞增殖，進而緩解關(guān)節(jié)炎癥。本研究中TRAIL-/-結(jié)腸炎小鼠的Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量變化與上述發(fā)現(xiàn)有一定差異，可能與所研究的疾病背景、研究方法以及TRAIL信號通路干預(yù)措施不同有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示TRAIL基因敲除能加重TNBS誘導(dǎo)的小鼠實驗性結(jié)腸炎的腸道炎癥反應(yīng)，其機制可能與Th17/Treg細(xì)胞比例上調(diào)有關(guān)。TRAIL影響Th17和Treg細(xì)胞的確切機制有待后續(xù)體外研究進一步探索。