綦向軍 陳國銘 史佩玉 張兆萍 方彩珊 鄭深建 邢萬里 黎健敏 周潤吉 徐福平

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 5104052.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院治未病中心，廣東 廣州 510120

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見的全身性骨骼疾病之一，以骨量降低，骨組織微結構破壞，骨脆性增加為特征，以致骨折易于發(fā)生[1]。骨質疏松癥是一種年齡相關性疾病，隨著人口老齡化的進展，OP發(fā)病率逐漸升高，早期流行病學調查顯示：我國50歲以上女性OP發(fā)病率為20.7%，男性為14.4%；60歲以上人群患病率明顯增高[2]。據(jù)2015年預測，我國在未來20年、40年間用于骨質疏松癥的費用分別高達1 320億元、1 630億元[3]。因此，OP儼然成為我國嚴重的公共衛(wèi)生問題，預防以及早期治療具有重要的臨床意義。

仙靈骨葆膠囊是根據(jù)苗族驗方研制而成的成方制劑，全方由淫羊藿、續(xù)斷、補骨脂、地黃、丹參、知母6味中藥組成，具有滋補肝腎、強筋壯骨的功效，目前廣泛應用于骨質疏松癥、骨折、骨關節(jié)炎等疾病[4]，而在OP的運用方面尤為突出。王桂倩等[5]對仙靈骨葆膠囊治療原發(fā)性OP的隨機對照試驗進行Meta分析后表明，仙靈骨葆膠囊單用或與其他西藥聯(lián)合使用，在治療骨質疏松癥方面的療效優(yōu)于單用西藥治療；安一方等[6]對仙靈骨葆膠囊治療絕經后OP的隨機對照試驗進行Meta分析后表明仙靈骨葆膠囊在改善腰椎骨密度、提高臨床有效率及改善疼痛方面療效確切；章秩立等[7]通過對仙靈骨葆膠囊安全性進行系統(tǒng)評價，認為其總體安全性可接受。故宏觀上已有大量的循證醫(yī)學證據(jù)表明仙靈骨葆運用于OP具有較好的療效和安全性，但對于其微觀藥理作用機制尚缺乏全面、系統(tǒng)的闡述，而傳統(tǒng)藥理學為證明藥物與疾病的關系時，常常通過設置對照實驗、控制藥物變量，研究其對疾病靶蛋白的親和力、特異性以揭示藥物對疾病的起效機制[8]，與中藥“多組分、多靶點、多通路”的機制特點不符。網絡藥理學的概念最初由Hopkins[9]提出，相較于傳統(tǒng)藥理學相比，網絡藥理學更加注重多組分、多靶點、多通路的協(xié)同作用，與中藥的特點相符，目前網絡藥理學在中藥作用機制研究、新藥挖掘、老藥新用等方面廣泛運用[10]。本研究擬運用網絡藥理學的研究方法進行探究。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

本研究所運用的數(shù)據(jù)庫及軟件如下：①中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[11]；②中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Information Database，TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/)[12]；③Cytoscape3.7.1軟件；④STRING數(shù)據(jù)分析平臺(https://string-db.org/)[13]；⑤GeneCards: The Human Gene Database(https://www.genecards.org/)[14]；⑥DAVID數(shù)據(jù)分析平臺(https：//david.ncifcrf.gov/)[15]。

1.2 仙靈骨葆膠囊活性成分及其靶標的獲取

TCMSP中收錄了500多種中藥以及30 069個中藥化合物，TCMID中收錄了8 159味中藥以及25 210種中藥化合物，運用TCMSP、TCMID分別檢索淫羊藿、續(xù)斷、補骨脂、地黃、丹參、知母，獲取相應的藥效成分。將口服利用度(oral bio-availability，OB)設置為≥30%，類藥性(drug likeness，DL)設置為≥0.18進行活性成分篩選，并運用TCMSP查找成分所對應的靶點信息，將所得數(shù)據(jù)去重后輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺獲取靶點的標準基因名稱。

1.3 仙靈骨葆“活性成分-作用靶標”網絡構建

運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制“活性成分-作用靶標”網絡圖。將上述活性成分及靶標信息導入軟件，根據(jù)軟件所提供的“network analyzer”功能進行網絡拓撲學分析，以靶點度值(degree)和中介中心度(betweenness centrality)評價仙靈骨葆核心成分以及靶點[13]。

1.4 蛋白互作PPI網絡構建

將所得靶標信息上傳至STRING數(shù)據(jù)分析平臺，數(shù)據(jù)分析模式設定為“Multiple proteins”，物種限制為“Homo sapiens”，提取靶點所對應的基因信息。對數(shù)據(jù)進行預讀后將置信度設置為≥0.98，并將孤立蛋白進行隱藏，最后輸出PPI蛋白網絡互作圖(protein-protein interaction network，PPI network)。

1.5 骨質疏松癥靶標基因的獲取

以“osteoporosis”為關鍵詞從GeneCards: The Human Gene Database獲取骨質疏松癥疾病基因，與仙靈骨葆靶點基因對比后篩選出仙靈骨葆治療骨質疏松癥的關聯(lián)基因數(shù)據(jù)。

1.6 KEGG通路富集以及GO生物過程富集分析

將仙靈骨葆治療骨質疏松癥的靶點基因上傳至DAVID數(shù)據(jù)分析平臺進行KEGG通路富集以及GO生物過程富集分析，分析時將物種限定為“Homo sapiens”。提取P<0.05的通路以及生物過程，運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制仙靈骨葆治療骨質疏松癥的“靶點-通路”網絡圖。

2 結果

2.1 仙靈骨葆活性成分的篩選以及相應作用靶標的獲取

以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共獲得活性成分115種，其中淫羊藿23種，續(xù)斷8種，熟地黃2種，丹參65種，知母15種，補骨脂2種。詳見表1。

表1 核心活性成分及靶標Table 1 The core active components and targets

2.2 仙靈骨葆“活性成分-作用靶標”網絡圖

運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制仙靈骨葆“活性成分-作用靶標”網絡圖，詳見圖1。網絡圖中藍色圓形節(jié)點為作用靶標，黃色多邊形節(jié)點為活性成分，線條代表活性成分與靶標具有對應關系，共計396個節(jié)點，其中活性成分節(jié)點95個，靶標節(jié)點301個，MOL009317、MOL008188、MOL009322等20個化合物未查詢到對應的靶標節(jié)點，故未納入到網絡圖中。節(jié)點的Degree值代表網絡中與節(jié)點進行連接的線條數(shù)。將其網絡拓撲學分析結果導出后示：平均節(jié)點度值為8.187 817 259，大于該度值的節(jié)點共有96個，平均中介中心度為0.005 437 999，大于平均中介中心度的節(jié)點有52個。節(jié)點所對應的節(jié)點度值以及中介中心度越高表明所對應的活性成分或靶點越可能是網絡圖的核心，可作為對仙靈骨葆治療骨質疏松癥的機制預測依據(jù)。Degree值及中介中心度均大于平均值的活性成分及靶標按照Degree進行降序排列后詳見表1。

圖1 仙靈骨葆“活性成分-作用靶標”網絡圖Fig.1 The active component-target network of XianlingGubao Capsule

2.3 仙靈骨葆治療骨質疏松癥的交集基因篩選

將活性成分作用靶點轉化為基因信息后與骨質疏松癥疾病相關基因進行對比后共篩得交集基因143個。詳見表2。

表2 仙靈骨葆治療骨質疏松癥交集基因Table 2 The related genes of XianlingGubao Capsule in treating osteoporosis

2.4 仙靈骨葆PPI網絡構建

運用STRING數(shù)據(jù)平臺對仙靈骨葆進行蛋白互作網絡分析，設置置信度≥0.98，并且隱藏孤立蛋白后得到仙靈骨葆PPI網絡圖，共得到111種蛋白之間的互作關系，詳見圖2，圖中圓形節(jié)點代表靶蛋白，蛋白之間線條的顏色代表蛋白之間不同的作用關系，詳見圖3。所得PPI網絡圖平均節(jié)點度值為4.145 454 545，大于該度值的節(jié)點共有34個，平均中介中心度為0.022 127 656，大于平均中介中心度的節(jié)點有20個。Degree值及中介中心度均大于平均值的活性成分及靶點詳見表3。

表3 PPI核心靶標蛋白Table 3 The core target proteins in PPI

圖2 仙靈骨葆PPI網絡圖Fig.2 The PPI network of XianlingGubao Capsule

圖3 蛋白互作關系注釋圖Fig.3 The annotation of PPI network注：known interactions：已知的相互作用關系；from curated databases：數(shù)據(jù)庫獲??；experimentally determined：實驗驗證；predicted interaction：預測的相互作用關系；gene neighborhood：基因鄰域；gene fusions：基因融合；gene co-occurrence：基因共現(xiàn)；others：其他；textmining：文本挖掘；co-expression：共表達；protein homology：同源蛋白

2.5 GO生物過程富集以及KEGG通路富集

運用David數(shù)據(jù)分析平臺對仙靈骨葆治療骨質疏松癥關聯(lián)基因進行GO生物過程富集以及KEGG通路富集。分別計算相應富集結果的P值(采用Bonferroni法進行校正，P<0.05時富集顯著)，并提取具有意義的富集結果。GO生物過程富集共獲得612項，僅取富集基因數(shù)≥10的過程進行展示，詳見表4。KEGG通路富集共獲得37項，僅TGF-β通路P值大于0.05，詳見表5，運用Cytoscape 3.7.1對其進行網絡可視化，詳見圖4，圖中粉紅色三角形節(jié)點代表通路，藍色圓形節(jié)點代表基因，線條代表通路與基因之間的對應關系。

表4 GO生物過程富集展示Table 4 The results of GO biological processes enrichment analysis

表5 KEGG通路富集圖Table 5 The results of KEGG pathways enrichment analysis

圖4 “通路-靶標”網絡圖Fig.4 The pathway-target network

3 討論

骨重建失衡，骨吸收/骨形成比例升高是導致骨量丟失的直接原因。成骨細胞以及破細胞在骨重建的過程中扮演著重要的角色，成骨細胞由間充質干細胞分化而來，成骨細胞可分泌骨基質，骨基質經羥基磷灰石沉積后即完成礦化，礦化完成標志骨重建過程結束[16]；破骨細胞由單核巨噬細胞前體分化而成，主司骨的吸收[17]，因此成骨細胞與破骨細胞的比例是骨質疏松癥發(fā)生的關鍵也是治療的干預重點。OP可分為老年性、絕經后以及特發(fā)性，老年性OP成因主要為隨著年齡增加，骨重建平衡被打破，造成骨量進行性丟失，絕經后OP除增齡因素外，雌激素水平降低是更為重要的因素[18]，而特發(fā)性骨質疏松癥主要發(fā)生于青少年，目前病因尚不明確[19]。OP的發(fā)病機制大體如上述，但具體的調節(jié)機制受到諸多途徑的影響，本研究將從網絡藥理學分析所得結果對仙靈骨葆治療OP的潛在機制進行討論。

3.1 活性成分與靶標

高度值以及高中介中心度活性成分中槲皮素、山奈酚、木犀草素、淫羊藿苷元等均為黃酮類化合物，現(xiàn)有研究表明黃酮類化合物主要通過雌激素受體介導、OPG/RANK/RANKL、酶抑制作用、過氧化物酶增殖子激活受體介導、調節(jié)信號轉導通路等機制預防OP[20]。槲皮素、山奈酚同屬于黃酮醇類，目前對于槲皮素治療OP較為明確的機制為抑制RANKL的活化[21]，OPG/RANK/RANKL機制是破骨細胞生成的關鍵，RANK與RANKL結合是促進破骨細胞分化的重要環(huán)節(jié)[22]，因此槲皮素可以抑制破骨細胞的生成，減少骨吸收。Kim等[23]發(fā)現(xiàn)山奈酚可抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin，IL-6)的分泌，而TNF-α、IL-6可誘導巨細胞集落刺激因子(macro-phagecolony-stimulatingfactor，M-CSF)以及RANKL的表達，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞[18]。淫羊藿苷元及其苷類在體內外均有增強成骨細胞活性，抑制破骨細胞活性的作用，而以淫羊藿苷元的作用最強[24]。除黃酮類活性成分外，丹參的活性成分較多，如丹參酮IIA、隱丹參酮等，丹參具有抗氧化、改善微循環(huán)，防止血栓等功能，但是近年來許多研究表明丹參及其有效成分具有抗OP或者改善骨代謝的作用[25]，如丹參酮IIA可促進間充質干細胞向成骨細胞分化[26]、抑制破骨細胞生成前列腺素E2進而抑制骨吸收[27]。

高度值以及高中介中心度的靶標共有24個，其中PTGS2(COX-2)的度值和中介中心度遠高于其他靶標，推測PTGS2是仙靈骨葆的關鍵靶標。PTGS1(COX-1)是度值排列第2的靶標，與PTCS2均為前列腺素生成的主要限速酶[28]，而前列腺素可以誘導M-CSF以及RANKL的表達，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞功能[18]。此外在表1中AR(雄激素受體)至少與29個活性成分相關，現(xiàn)代研究表明雄激素與男性骨骼生長發(fā)育，骨量維持有關[29]，雄激素可以與成骨細胞表面的雄激素受體結合，促進成骨細胞分化[30]。ESR1(雌激素受體)至少與28個活性成分相關。二者均為仙靈骨葆的靶標核心。整個活性成分-靶標網絡圖靶標眾多，關聯(lián)復雜，可見仙靈骨葆的起效機制是多成分多靶點的相互作用，并且具有許多潛在的治療作用。

3.2 PPI網絡分析

PPI網絡拓撲學特征以細胞周期調節(jié)蛋白居多，高度值以及高中介中心度蛋白中TP53、AKT1、CDKN1A、JUN、CCNA2、CCND1、CDK1等蛋白均與細胞生長、分化、凋亡的調節(jié)有關，據(jù)此推測仙靈骨葆的作用特點在于調節(jié)成骨細胞以及破骨細胞的生長周期。值得一提的是表3中IL-6與STATA3之間的相互作用，陳鵬等[31]通過動物實驗表明將JAK2/STATA3通路阻斷引起IL-6無法表達后，骨質疏松癥大鼠骨密度及ALP水平低于未阻斷組。此外PPI網絡圖尚與炎性因子、雌激素等相關。

3.3 GO生物過程富集以及KEGG通路富集

富集基因數(shù)較多的GO生物過程所反映的內容與PPI網絡規(guī)律相似，均與細胞周期有關，炎癥反應(IL-6、CXCL8等)、雌二醇反應(ESR1)、血管新生反應(VEGFA)均可與PPI中的蛋白相對應。本研究所展示GO生物過程，正調控NF-kappaB轉錄活性因子為主要的過程之一，該過程與骨質疏松癥的相關機制吻合，即破骨細胞的激活依賴于核因子-κB受體活化配體[receptor activator of nuclear factor-κB (NF-κB) ligand，RANKL]與破骨細胞前體細胞上的RANK結合，從而激活NF-κB，促進破骨細胞分化[22]，骨質疏松癥基因富集于該過程，上調NF-κB表達，從而引起骨質疏松癥。而參與富集的基因均為仙靈骨葆所涉及的基因，說明仙靈骨葆膠囊可以對該過程進行調控，KEGG通路富集結果中NF-kappa B 信號通路富集了13個基因，亦佐證了這一結論。

KEGG通路富集結果中，富集基因數(shù)最多的通路為PI3K-Akt信號通路，有研究表明與正常小鼠相比Akt1和Akt2基因均敲除的小鼠骨量明顯下降，提示該通路與促進骨形成有關[32]。此外在對淫羊藿苷促進BMSCs分化的研究中發(fā)現(xiàn)加入PI3K阻斷劑后，淫羊藿苷的促進效果受到顯著抑制，提示該通路與BMSCs向成骨細胞分化有關[33]。TNF信號通路是富集基因數(shù)排列第2的通路，目前有研究表明，炎性因子TNF-α是絕經后OP發(fā)生的主要原因之一，TNF-α可促進RANKL表達，誘導破骨細胞形成[34]。MAPK信號通路是調節(jié)成骨細胞生長分化的重要途徑，其中具有抗OP作用的主要有ERK通路、p38通路以及JNK通路，ERK通路可以促進骨保護素(osteoprotegerin，OPG)表達[35]，而OPG可以與RANK競爭性結合RANKL從而導致破骨細胞的凋亡[36]；p38通路則可以促進成骨細胞的礦化過程[37]；有研究表明JNK通路缺失后成骨細胞骨鈣蛋白以及骨橋蛋白表達明顯下降，因此JNK信號通路可能與成骨細胞后期分化有關[38]。KEGG通路結果中部分通路之間表現(xiàn)出協(xié)同作用，如HIF-1信號通路與VEGF通路，VEGF可作為HIF-1的下游目的基因，共同參與血管-骨形成的耦聯(lián)[39]；再如TGF-β信號通路、mTOR信號通路、AMPK信號通路，TGF-β1可以募集成骨細胞前體細胞，而成骨細胞可以分泌OPG，OPG可以通過mTOR信號通路以及AMPK信號通路轉導信號，抑制破骨細胞分化；朱云艷等[38]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體通路過表達可引起MAPK以及Akt磷酸化水平的下降。目前有研究表明甲亢是OP的危險因素之一，甲亢可致骨密度下降，由此可以推測，仙靈骨葆或可用于存在甲亢的OP患者。Prolactin(泌乳素)、Estrogen(雌激素)以及GnRH信號通路表明仙靈骨葆具有雌激素調節(jié)作用，是仙靈骨葆可運用于絕經后OP的證據(jù)。

綜上所述，仙靈骨葆主要通過影響成骨細胞以及破骨細胞生長分化，調節(jié)骨代謝、雌激素等途徑干預OP。仙靈骨葆生物網絡復雜龐大，本研究通過構建“活性成分-靶標”網絡對仙靈骨葆的核心活性成分以及靶標進行了預測，PPI網絡對仙靈骨葆核心蛋白之間相互作用進行分析，運用David數(shù)據(jù)分析平臺進行GO生物富集以及KEGG通路分析，預測仙靈骨葆治療OP的起效機制，并引證現(xiàn)有研究結果進行對比，所得結果真實可信，為后續(xù)的仙靈骨葆藥理機制分析和實驗設計提供了數(shù)據(jù)支持。