張瑋瑋，鄭司浩，王永輝，王 偉，張志鵬，蔡翠芳

（1. 山西藥科職業(yè)學院 太原 030031；2. 山西中醫(yī)藥大學 榆次 030600；3. 中國中藥有限公司 北京 100195；4. 山西國新晉藥集團有限公司 太原 030032）

天麻為蘭科天麻屬植物天麻Gastrodia elataBl．的干燥塊莖[1]，是我國的名貴中藥材之一，也是重要的藥食兩用中藥材。具有平抑肝陽、息風止痙、祛風通絡的功效[1]。其主要成分有天麻素、天麻苷元等酚類化合物及多糖類、甾醇、有機酸等[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明天麻具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、促進睡眠和神經(jīng)保護作用等作用[5-9]。臨床上用于治療高血壓、偏頭痛及心腦血管等疾病[10-11]。天麻炮制方法始于《雷公炮炙論》記載用蒺藜煨法，后經(jīng)改良為酒浸和加熱等方面[12]，目前加工方法多采用蒸制法或水煮法，起到“殺酶保苷”的作用[13]，不同的炮制方法會導致天麻素成分的部分損失，不同的產(chǎn)地加工和干燥方式也會影響藥材品質(zhì)的形成[14-15]。此外，目前對天麻品質(zhì)考察多基于測定天麻素及羥基苯甲醇的含量[16-17]。本研究分別采用曬干、熱風干燥、冷凍干燥、減壓干燥處理方式對新鮮天麻切片進行干燥加工，以及進行煮制、微波炮制、蒸制、酒制、姜制、蜜制等炮制加工，建立HPLC 法同時測定天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 等6 種化合物有效含量，以及通過苯酚-硫酸法測定多糖含量變化，旨在觀察不同干燥方法和炮制工藝的差異，同時為天麻的產(chǎn)地加工提供有效方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200-液相色譜儀（Agilent 公司，包括四元梯度泵、在線脫氣機、DAD 檢測器）；METTLER AB135-S 型電子天平（瑞士）；Agilent HC-C18 色譜柱（4.6 × 250 mm，5 μm）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SL-500A 型高速多功能粉碎機（北京恒瑞森科技開發(fā)有限責任公司）；101-0AB 型電熱鼓風干燥箱、DRT-TW 型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；LGJ-10型真空冷凍干燥機（寧波新藝超聲設備有限公司）；L5 型紫外-可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；GL-20G-Ⅱ型離心機（上海安亭科技儀器廠）；P70D20TL-D4 型微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）。

天麻素對照品（批號16081941，純度98.0%），購自上海同田生物技術有限公司、對羥基苯甲醇照品（批號111910-201501，純度98.5%），D-無水葡萄糖對照品（批號110833-201506，純度99.9%）購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷A、B、C、E（實驗室自制，純度≥98%），乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；其他試劑均為分析純。天麻藥材采自貴州道真縣，經(jīng)山西藥科職業(yè)學院蔡翠芳教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖。

2 樣品制備

2.1 不同干燥方法

取大小均勻且等級為100-150 g/支的新鮮天麻2000 g，手 工 切1-2 mm 的 薄 片，得1911 g（得 率95.55%），備用。按照以下四種干燥方法處理后，每種方法取新鮮天麻片100 g 左右，重復3 次。①曬干：日光下常溫晾曬至干；②減壓干燥：放于60℃真空干燥箱里烘干；③冷凍干燥：冰箱預凍2小時后放入冷凍干燥機中48 h，真空抽干；④熱風干燥：放于100℃干燥箱里干燥。

2.2 不同炮制方法

取大小均勻且等級為100-150 g/支的新鮮天麻2000 g，手 工 切1-2 mm 的 薄 片，得1918 g（得 率95.90%），備用。按照以下六種炮制方法處理后，每種方法取新鮮天麻片100 g 左右，重復3 次。①煮制：放入沸水中煮5 min，再于60℃烘箱熱風干燥；②蒸制：在蒸鍋上蒸10 min，再于60℃烘箱熱風干燥；③微波炮制：放于微波爐（功率800 W）加熱1 min，然后隔水蒸10 min，取出60 ℃烘干；④酒制：與黃酒拌勻，放置悶潤過夜，然后隔水蒸10 min，取出60 ℃烘干；⑤姜制：與姜汁拌勻，悶潤過夜，隔水蒸10 min 后取出60 ℃烘干；⑥蜜制：用蜜汁包裹均勻，然后隔水蒸10 min，取出60 ℃烘干。

2.3 含量測定

2.3.1 對照品溶液制備

精密量取天麻素、對基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E對照品適量，置25 mL容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）稀釋至刻度，搖勻，分別制成 0.0819、0.1631、0.0862、0.1007、0.0984、0.0917 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備

精密稱取0.5 g 天麻粉末，置入具塞錐形瓶，精密加入25 mL 稀乙醇，稱重，超聲30 min（功率300 W，頻率25 Hz），放置室溫后再稱重，用稀乙醇補足重量，過濾，精密量取10 mL續(xù)濾液，濃縮至干，殘渣加乙腈-水（3:97）混合液溶解，移至10 mL 容量瓶中定容，搖勻，過濾，即得[1]。

色譜條件采用Agilent HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.05% 磷酸（B）為流動相，梯度洗脫（0 - 10 min，2% - 10% A；10 - 60 min，10% - 40%A），檢測波長220 nm，體積流量1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣體積10 μL，理論塔板數(shù)以天麻素計算不低于3000[1]。

2.3.3 苯酚-硫酸法測定多糖的含量

葡萄糖對照品溶液的制備：精密稱取D-無水葡萄糖對照品加純水溶解，搖勻，得到1 mg·mL-1的對照品溶液，備用。分別吸取該貯備液0.1、0.2、0.5、1、2 mL于10 mL 量瓶中，加純水定容至刻度，搖勻[18]。再分別吸取1.0 mL 不同濃度梯度的葡萄糖溶于具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻；加5.0 mL 濃硫酸，搖勻靜置10 min 后，沸水浴15 min，冷卻至室溫，空白溶液調(diào)0，在490 nm波長下測定吸光度[18]。

天麻多糖的提?。悍謩e精密稱取不同處理方法的天麻飲片粉末0.5 g，置于燒瓶中加80%乙醇50 mL，回流2 次，每次60 min，趁熱過濾，棄去濾液，殘渣揮去乙醇，殘渣加純水100 mL 提取2 次，每次60 min，趁熱過濾，放冷后移入500 mL 量瓶，加純水至刻度作為天麻多糖提取液，備用。

天麻多糖的含量測定：分別精密吸取上述天麻多糖的提取液0.2 mL，置具塞試管中加蒸餾水至1.0 mL，搖勻，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置10 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，每種方法提取液3 次平行顯色，采用分光光度法490 nm 處測定。由于蜜制天麻在加工中添加了蜜汁輔料，會對天麻多糖含量的測定造成干擾，因此蜜制天麻的多糖含量測定結果僅做參考。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 標準曲線的繪制

分別精密量取混合對照品貯備液并置入10 mL容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。分別吸取10 μL不同濃度的對照品溶液及原濃度儲備液，按“2.3.2”項下色譜條件進行檢測，記錄各化合物色譜峰面積。按照橫坐標（X）為質(zhì)量濃度（μg·mL-1）、縱坐標（Y）為峰面積繪制標準曲線，最終計算得出各化學成分的回歸方程（見表1）。6 種化學成分的r值均＞0.9990，表明其在各自線性范圍內(nèi)呈良好線性關系。

表1 六種化學成分的回歸方程

3.1.2 精密度試驗

分別精密吸取10 μL同一對照品溶液，連續(xù)進樣6次，按照“2.3”項下方法測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A 等6 種化學成分的色譜峰面積，經(jīng)計算6 種化學成分的RSD 值分別為0.8%、0.5%、0.4%、0.4%、0.6%、0.4%，結果表明儀器具有良好的精密度。

3.1.3 重復性試驗

取6 份同一樣品（S1），按“2.3”項下方法進行供試品溶液制備和含量測定，記錄天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A 等6 種化學成分的色譜峰面積，經(jīng)計算6種化學成分的RSD 值分別為1.0%、0.9%、0.7%、0.8%、1.6%、1.4%，結果表明該方法具有良好的重復性。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗

取一份天麻藥材粉末（S1）按“2.3.2”項下方法進行供試品溶液制備。供試品溶液在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后，按照時間梯度進樣測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A 等6種化學成分的色譜峰面積，經(jīng)計算6 種化學成分的RSD 值分別為0.2%、0.4%、0.3%、0.2%、0.2%、0.3%，結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.5 加樣回收率試驗

精密稱定9 份0.5 g 已知含量的同一樣品（S1），置入錐形瓶分別精密加入低、中、高3個濃度水平的混合對照品，每個劑量平行3份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液并進行檢測，經(jīng)計算得出6 種化學成分的加樣回收率均在95%-105%且RSD值＜3%，見表2。

表2 六種化學成分加樣回率收試驗結果

3.2 不同干燥方法處理的天麻中6 種化學成分含量測定

取不同干燥方法處理后的天麻，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液并按其色譜條件進樣測定，混合對照品及天麻樣品HPLC 色譜圖見圖1。按“3.1”項下回歸方程計算天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的含量，結果見表3。由表可知，采取冷凍干燥處理的天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C及巴利森苷E六種化學成分的含量均高于經(jīng)曬干、熱風干燥、減壓干燥處理后的天麻。

圖1 天麻HPLC色譜圖（左圖為混合對照品，右圖為樣品）

表3 不同干燥方法處理的天麻樣品中六種化學成分及多糖含量（單位：%；n = 3）

表4 不同炮制方法處理的天麻樣品中六種化學成分及多糖含量（單位：%；n = 3）

3.3 不同炮制方法處理的天麻中6 種化學成分含量測定

取不同炮制方法處理后的天麻，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液并按其色譜條件進樣測定，并按“3.1”項下回歸方程計算6個化學成分的含量，結果見表4。由表可知，在微波炮制、煮制、蒸制、酒制、姜制、蜜制等六種炮制方法中，經(jīng)微波炮制處理的天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C及巴利森苷E等六種化學成分的含量均高于其他五種炮制方法處理后的天麻。

3.4 不同加工方式處理的天麻中多糖含量測定

按“2.3.3”項下方法，以質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=31.621X+0.0362（r=0.9990，n=6），表明葡萄糖濃度在0 - 200 μg/mL 內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。每份天麻樣品粉末稱取2份，按“2.3.3”項下方法測定，并計算不同工藝條件下天麻中多糖的含量。4種不同干燥方法條件下天麻中多糖含量見表3，結果表明經(jīng)冷凍干燥的天麻中多糖含量最高為16.62%。6種不同炮制方法條件下天麻中多糖含量見表4，結果表明經(jīng)微波炮制的天麻中多糖含量最高（16.56%），蒸制天麻（15.58%）多糖含量次之。

4 討論

中藥材產(chǎn)地加工干燥方法對其有效成分含量和外觀具有顯著影響，而中藥炮制是傳統(tǒng)中醫(yī)藥體系的重要組成部分，也是中藥現(xiàn)代化的的關鍵環(huán)節(jié)，兩者均影響中藥飲片質(zhì)量穩(wěn)定和中藥治療的效果[19-21]。本研究以天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和多糖作為主要指標，評估不同干燥方法和炮制方法處理后天麻藥材的品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)天麻不同干燥品的指標成分含量存在差異性，其中曬干處理的天麻樣品未能夠達到2015 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定（含天麻素和對羥基苯甲醇的總量不得少于0.25%），僅為0.11%；減壓干燥、冷凍干燥、熱風干燥處理后的天麻樣品均達到2015 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定且差異較小，為0.32% -0.42%。減壓干燥和冷凍干燥的樣品中天麻素的含量高于其他處理方式。文獻報道巴利森苷類成分不穩(wěn)定，在不同溫度、溶劑條件下，含量差別很大，與天麻素之間存在相互轉(zhuǎn)化見圖2[22]。在冷凍干燥時，低溫狀態(tài)下可降低相關酶的活性從而阻止活性成分降解；減壓干燥時，真空狀態(tài)容易破壞細胞結構，從而減少酶促反應的發(fā)生，且利于活性成分的溶出；熱風干燥時，天麻隨著溫度的增加，其相關酶活性逐步增加然后降低直至失去活性，由于熱風干燥耗時較短，因此其活性成分降解程度較低；而在曬干時，耗時較長，常溫狀態(tài)有利于化學成分之間酶促反應的形成，不能起到“殺酶保苷”的效果，導致活性成分發(fā)現(xiàn)降解，從而各項指標均較低。減壓干燥和冷凍干燥這兩種方法可在保護活性成分的流失的同時，還能使得加工的樣品保持較好的外觀品相，是干燥天麻的理想之法。

圖2 巴利森苷降解途徑

目前，為減少天麻有效成分損失，達到“殺酶保苷”的效果，實際生產(chǎn)中其炮制多以蒸法為主。本研究在比較天麻不同炮制方法（煮制、蒸制、微波炮制、酒制、姜制、蜜制）的指標成分含量時，發(fā)現(xiàn)不同炮制品的指標成分含量存在差異性，天麻素和對羥基苯甲醇總量為0.27% - 0.52%變幅較大，但均符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。本研究表明，微波炮制所得天麻樣品中的6種化學成分和多糖含量較其它炮制方法高，其次為蜜制、煮制、蒸制，最后為酒制、姜制，與文獻報道一致[23]。酒制、姜制對天麻前處理時需要悶潤過夜，再行隔水蒸。而在悶潤過夜這一較長的前處理過程，天麻內(nèi)部的活性成分在酶的活性作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化和分解，使得酒制、姜制天麻樣品檢測到的成分含量較低；煮制、蒸制、蜜制前處理過程較短，便煮或蒸，可以及時的進行加溫處理，經(jīng)過高溫使酶類失活，最大程度上保護了活性成分不被酶水解，但緩慢的加熱過程也不可避免活性成分被酶水解，直至高溫使得酶類失活。而微波炮制的原理是利用短波長、高頻率的電磁波使以水分子為主的極性分子振動摩擦而產(chǎn)生大熱量，并以熱的形式在物料內(nèi)表現(xiàn)出來，從而使物料在短時間內(nèi)加熱、干燥或熟化[24]。對天麻進行的微波炮制，將鮮天麻進行1 min 微波加熱處理后再隔水蒸，而微波能量集中穩(wěn)定、加熱效率高的特點，有利于在很短的時間內(nèi)破壞天麻的酶活性，阻礙各化學成分間的轉(zhuǎn)化，同時微波其穿透力強的特點更有利于化學成分的溶出，F(xiàn)an 等的研究表明微波炮制可以提高天麻中天麻素、對羥基苯甲醇等成分的含量[25]，故微波炮制所得天麻樣品中的天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和多糖含量較其它炮制方法高。因此，基于未來新型設備的發(fā)展，微波干燥可作為天麻產(chǎn)地加工的發(fā)展方向。

以上實驗表明，最佳干燥方法為減壓干燥和冷凍干燥，最佳炮制方法為微波炮制，可為天麻加工生產(chǎn)工藝的制定提供一定的方法學參考和科學理論支撐。為保證天麻的質(zhì)量穩(wěn)定，制定出天麻加工炮制規(guī)范，還需對天麻的加工和炮制過程進行量化，并從經(jīng)濟可行性的角度進行評價以確保能夠匹配到實際生產(chǎn)應用。