張小瓊，沈偉，劉杰，施昕瀾，朱冰清，姜晟

(1.江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，江蘇 常州 213001；2.江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 常州 213001；3.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210019)

我國對化工污水處理廠排放的廢水主要檢測其理化因子，并頒布了相應(yīng)的排放標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，但大量新型污染物對環(huán)境和人體健康也存在巨大影響，常規(guī)理化因子的檢測已不能滿足污染控制的需求。目前，已有一些國家針對環(huán)境生物毒性制定了檢測和評估標(biāo)準(zhǔn)，并規(guī)定了污染物排放限值。我國在2008年制藥工業(yè)系列排放標(biāo)準(zhǔn)(GB 21903—GB 21908)中首次引入了綜合毒性指標(biāo)，后續(xù)在2015年頒布的《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(征求意見稿)[3]和2017年頒布的《農(nóng)藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(征求意見稿)[4]中，對城鎮(zhèn)污水和農(nóng)藥工業(yè)水污染物排放限值分別引入了4項綜合毒性指標(biāo)。德國污水排放標(biāo)準(zhǔn)[5]采用5項綜合毒性指標(biāo)，對不同化工行業(yè)提出不同的排放限值。

近年來，采用的生物毒性效應(yīng)檢測方法包括：發(fā)光細(xì)菌急性毒性[6-7]，藻類熒光抑制毒性[8-9]，斑馬魚急性毒性[10-11]，遺傳毒性[12-13]，以及內(nèi)分泌干擾物毒性[14-15]等。使用不同類型組合的生物毒性檢測，對環(huán)境中各層次生物毒性效應(yīng)進(jìn)行綜合評價已成為主流[16-19]。

鄒葉娜等[20]運(yùn)用成組生物毒性測試法對典型工業(yè)廢水的綜合生物毒性進(jìn)行了評價，并評估了處理工藝對毒性的削減情況。陳玲等[21]運(yùn)用毒性鑒別評價(TIE)技術(shù)進(jìn)一步對工業(yè)廢水中的致毒物質(zhì)進(jìn)行了鑒別。

因各工業(yè)園區(qū)內(nèi)企業(yè)類型存在差異，且配套的污水處理廠廢水處理工藝流程不同，廢水成分差異較大。本研究選擇了常州2個污水處理廠為研究對象(以下簡稱“常A”和“常B”)，常A污水處理廠主要處理生產(chǎn)化工原料、化工新材料、生物化工、新領(lǐng)域精細(xì)化工等產(chǎn)生的污水，設(shè)計污水處理能力為30 000 m3/d。常B污水處理廠主要處理以機(jī)械、織造為主的輕污染工業(yè)污水，配備了3輛10 t槽罐車從事工業(yè)廢水的收集、運(yùn)輸、處理工作，設(shè)計污水處理能力為5 000 m3/d。2個污水處理廠處理后的尾水最終都匯入自然水體?，F(xiàn)選擇4種不同生物層次的生物急性毒性檢測方法組合進(jìn)行研究，比較不同類型污水處理廠廢水的差異，了解4種生物急性毒性檢測方法的適用性，以期為化工園區(qū)廢水的生物毒性削減管理提供方法和依據(jù)。

1 研究方法

1.1 樣品采集

按照《地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》(HJ/T 91—2002)[22]要求進(jìn)行樣品采集。采樣點位：污水處理廠進(jìn)水口、尾水排放口、受納河道上游100 m、受納河道下游100 m。采樣頻次：1次/2周，每批次樣品空白、平行樣各1個。采集后在4 ℃下于冷藏箱中保存運(yùn)輸，至實驗室后立即分析，不能立即分析的，按方法要求冷凍或冷藏。

1.2 儀器與受試生物

儀器：DeltaTox發(fā)光細(xì)菌毒性檢測儀(美國SDI公司)；TOXY-PAM葉綠素?zé)晒舛拘詼y定儀(上海澤泉科技股份有限公司)；SMZ 1000體式顯微鏡(日本尼康公司)。

受試生物：費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)，購自英國Modern Water公司；斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)，菌種購自中國科學(xué)院淡水藻種庫，江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心自行繁育；大型溞(Daphniamagna)，溞種由南京大學(xué)提供，江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心自行繁育；魚卵取自斑馬魚(Daniorerio)，種魚購自國家斑馬魚資源中心，江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心自行繁育。

1.3 生物毒性檢測方法及評價指標(biāo)

發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢測方法為《水質(zhì) 水樣對弧菌類光發(fā)射抑制影響的測定(發(fā)光細(xì)菌試驗)》 第3部分:使用凍干細(xì)菌法(ISO 11348-3-2007)[23]；藻類葉綠素?zé)晒舛拘詸z測參考SCHREIBER等[24]的方法；大型溞急性毒性檢測方法為《大型溞急性毒性實驗方法》(GB/T 16125—2012)[25]；斑馬魚卵急性毒性檢測方法為《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)[26]。

相對發(fā)光率(L)>90%，為無毒；70%

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)光細(xì)菌急性毒性

常A污水處理廠排放的尾水最后進(jìn)入長江干流，因水流量巨大，未采集受納水體代表樣品，僅對水廠進(jìn)出水進(jìn)行了發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢測。圖1為常A進(jìn)出水樣相對發(fā)光率實驗結(jié)果。進(jìn)出水口樣品經(jīng)過8次檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)光細(xì)菌急性毒性介于無毒至高毒，表明每次檢測的進(jìn)水樣品毒性差異較大，可能與所含有毒物質(zhì)類型和濃度的變化有關(guān)。出水口樣品發(fā)光細(xì)菌急性毒性介于無毒至低毒，且投放的消毒用氧化劑逐漸耗盡后，后續(xù)也未檢測出急性毒性，表明該處理廠污水經(jīng)深度處理后，毒性削減較大。

圖1 常A進(jìn)出水樣相對發(fā)光率實驗結(jié)果

常B污水處理廠采用槽罐車非定時收集各企業(yè)污水，污水量和來源不穩(wěn)定，其出水通過廠門口的水溝流入附近水體。圖2為常B進(jìn)出水樣相對發(fā)光率實驗結(jié)果。進(jìn)水口樣品經(jīng)過2次檢測，相對發(fā)光率為15.8%和5.70%(均為高毒)，2次出水口樣品檢測結(jié)果差異較大，相對發(fā)光率分別為0(劇毒)和84.7%(低毒)。當(dāng)受納河道上游水樣檢出為無毒(第1次檢測)，而出水發(fā)光細(xì)菌急性毒性為劇毒時，受納河道下游水樣急性毒性檢出為中毒，說明受納水體水容量較小時，下游水體的生物毒性會受到排放尾水的影響。該污水處理廠出水口樣品2次檢測的毒性差異顯著，可能與最后一道處理工藝投放氧化消毒劑有關(guān)。

圖2 常B進(jìn)出水樣相對發(fā)光率實驗結(jié)果

2家污水處理廠進(jìn)水均呈現(xiàn)較大毒性，分別經(jīng)過不同工藝處理后，毒性得到大幅削減。王麗莎等[28]檢測了北京市3個污水處理廠不同處理階段的發(fā)光細(xì)菌急性毒性，發(fā)現(xiàn)其隨工藝流程呈降低趨勢，最后出水表現(xiàn)出對發(fā)光細(xì)菌有抑制作用。殺菌用氧化消毒劑的使用對尾水毒性有較大影響，與本研究結(jié)果一致。宋瑩[29]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化消毒劑(余氯)對發(fā)光細(xì)菌的急性毒性會造成干擾。建議在進(jìn)行出水毒性檢測時，加入脫氯劑以減少氧化消毒劑引起的急性毒性，以便更好地反映真實的排水毒性。

2.2 藻類葉綠素?zé)晒庖种贫拘?/h3>

圖3為常A進(jìn)出水葉綠素?zé)晒舛拘砸种坡?，圖4為常B進(jìn)出水以及受納河道上下游藻類葉綠素?zé)晒獾亩拘砸种坡蕶z測結(jié)果(常A檢驗5次，常B檢測2次)。由圖3可見，常A所有檢測中，僅第1次進(jìn)水的熒光毒性抑制率>20%，其余未檢出明顯的毒性抑制效應(yīng)。由圖4可見，常B進(jìn)水具有明顯的熒光抑制毒性，第1次進(jìn)水抑制率最高值為62.88%，第2次進(jìn)水抑制率最高值為34.98%。第1次出水抑制率<20%，第2次出水抑制率>25%。受納河道上下游2次檢測，熒光抑制率均<20%，未發(fā)現(xiàn)明顯的藻類熒光抑制毒性。

圖3 常A進(jìn)出水葉綠素?zé)晒舛拘砸种坡?/p>

圖4 常B進(jìn)出水及受納河道上下游葉綠素?zé)晒舛拘砸种坡?/p>

常A和常B藻類熒光急性毒性檢測結(jié)果具有差異，可能由于2個污水處理廠進(jìn)水所含污水的成分不同，段靜波等[30]發(fā)現(xiàn)，Hg2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+4種重金屬離子混合后可對蛋白核小球藻產(chǎn)生聯(lián)合毒性。常B處理的廢水主要來源于機(jī)械和織造工業(yè)，其重金屬含量較高，因此檢測出較高的藻類葉綠素?zé)晒舛拘浴?/p>

常B排放的尾水其熒光抑制率低于進(jìn)水，說明處理工藝對藻類葉綠素的熒光抑制有一定的削減作用。戴迪楠[31]對污水處理廠各處理工藝段進(jìn)行了4種生物毒性的檢測，其中二級生物處理可有效減少藻類抑制毒性，削減幅度達(dá)94%以上，與本研究結(jié)果一致。

2.3 大型溞急性毒性

修訂的《農(nóng)藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(征求意見稿)對農(nóng)藥工業(yè)水污染物排放限值進(jìn)行了規(guī)定：大型溞急性毒性的限值為稀釋8倍后進(jìn)行 48 h測試，大型溞受抑制率≤10%，視為達(dá)標(biāo)。德國水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)對化工企業(yè)溞類毒性TD(DIN 38412-L30-1989)[32]規(guī)定的限值為：稀釋8倍后進(jìn)行24 h測試，測試終點為“均具有游動能力”。

對常A 8次進(jìn)出水原水水樣，以及10，100，1 000倍逐級稀釋的進(jìn)出水水樣進(jìn)行毒性檢測，均未檢測出大型溞的死亡，表明無急性毒性。表1為常B進(jìn)出水以及受納河道上下游大型溞存活數(shù)檢測結(jié)果，由表1可見，常B進(jìn)出水原水中大型溞全部死亡，進(jìn)出水均顯示出很強(qiáng)的急性毒性。隨稀釋倍數(shù)的增加，死亡率逐漸下降，稀釋至1 000倍，未檢測出急性毒性。而常B的進(jìn)出水稀釋10倍后死亡率為80%～100%；進(jìn)出水稀釋至100倍后，第2次采樣的進(jìn)水未檢測出急性毒性，其余死亡率為20%～40%，顯示毒性減?。幌♂屩? 000倍后未觀察到毒性。參照上述2個標(biāo)準(zhǔn)的排放限值，常B的出水不符合排放要求。

初步推斷該毒性來源為出水排放中添加的氧化消毒劑，朱英等[33]研究了含對氯間二甲苯酚、次氯酸鈉2種消毒劑對溞類的毒性，發(fā)現(xiàn)氧化消毒劑類的次氯酸鈉類比對氯間二甲苯酚類更高，對生態(tài)環(huán)境相對不友好。在本研究中，常B使用含氯氧化消毒劑，建議常B的排水用非氧化或其他對環(huán)境友好型消毒工藝進(jìn)行替代。若要減少對生態(tài)環(huán)境的影響，后續(xù)需進(jìn)一步查明大型溞毒性來源是否來自氧化消毒劑，并對應(yīng)進(jìn)行處理工藝的改進(jìn)，減低毒性后達(dá)標(biāo)排放。

表1 常B大型溞死亡率檢測結(jié)果① %

2.4 斑馬魚卵急性毒性

斑馬魚是水生生物毒性檢測普遍使用的模式物種，用于魚類生物毒性研究[34-35]。斑馬魚卵相對斑馬魚成魚在生物急性毒性檢測上具有顯著優(yōu)勢——個體小、數(shù)量大、檢測時間短，有毒物質(zhì)在生物發(fā)育過程中產(chǎn)生的影響更直觀。本研究采用斑馬魚卵來檢測水樣的毒性，對原水和5個稀釋度(50%，33%，25%，16.7%，12.5%)水樣的毒性來進(jìn)行評估。在測試中不產(chǎn)生測試效應(yīng)的最低稀釋倍數(shù)(lowest ineffective dilution，LID)指不少于90%魚卵存活時水樣的最低稀釋倍數(shù)。對常A和常B的進(jìn)出水以及受納河道上下游斑馬魚卵急性毒性進(jìn)行檢測，常A進(jìn)行8次檢測，常B進(jìn)行2次檢測。結(jié)果表明，常A進(jìn)出水原水基本未檢測出毒性，LID值為0，常B進(jìn)出水以及受納河道上下游斑馬魚卵急性毒性檢測結(jié)果見表2。由表2可見，常B 2次進(jìn)水的LID值均為16，出水分別為6和3，受納河道上下游均未檢出急性毒性。出水和受納河道下游雖檢測到的LID值不高，但存在斑馬魚卵各類發(fā)育畸形現(xiàn)象，出水原水稀釋3倍，受納河道原水稀釋2倍后仍可觀察到發(fā)育畸形，見圖5(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)。

表2 常B進(jìn)出水以及受納河道上、下游斑馬魚卵急性毒性檢測結(jié)果①

圖5 常B出水和受納河道下游斑馬魚卵發(fā)育畸形類型(斑馬魚卵發(fā)育照片放大倍數(shù)均為20×2倍)

2.5 篩選生物急性毒性檢測方法的應(yīng)用

發(fā)光細(xì)菌急性毒性、藻類葉綠素?zé)晒舛拘?、大型溞急性毒性、斑馬魚卵急性毒性4種生物急性毒性在常A和常B 2個污水處理廠的測試結(jié)果差異較大。發(fā)光細(xì)菌急性毒性、藻類葉綠素?zé)晒舛拘?項指標(biāo)在2個污水處理廠進(jìn)水中全部檢出，大型溞、斑馬魚卵急性毒性僅在常B中有檢出。對污水處理廠的尾水和受納河道的檢測中，僅發(fā)光細(xì)菌急性毒性在2個污水處理廠中有檢出。根據(jù)實驗結(jié)果，4項生物毒性指標(biāo)能夠滿足2個工業(yè)園區(qū)的生物毒性檢測，并有較好的指示效果，見表3。

表3 常A、常B污水處理廠4種生物監(jiān)測技術(shù)比較

廢水經(jīng)過處理后，污染物大幅減少，但尾水中仍然含有難降解的物質(zhì)，如重金屬、抗生素和藥物類化合物等，對受納水體水環(huán)境的影響不容忽視[36]。在規(guī)定生物指標(biāo)的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中，《德國水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》采用了5項生物毒性指標(biāo)，包括：魚卵毒性(Tegg)、溞類毒性(TD)、藻類毒性(TA)、發(fā)光細(xì)菌急性毒性(TL)和致突變性(基因毒性測試，umu測試)。參考該標(biāo)準(zhǔn)制修訂的《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(征求意見稿)保留了前4項，刪去了基因毒性測試，并同時規(guī)定了各指標(biāo)的排放限值。國內(nèi)也有一些研究采用多種生物毒性檢測方法組合對污水處理廠尾水的毒性進(jìn)行檢測，如田杰等[37]采用了青?；【鶴67和蠶豆根尖微核遺傳實驗對3個城市污水處理廠進(jìn)出水進(jìn)行了研究，劉存歧等[38]采用了羊角月牙藻、大型溞、斑馬魚、費(fèi)氏弧菌及蠶豆微核遺傳實驗進(jìn)行了污水處理廠尾水的研究。但其中使用的一些方法或?qū)θ藛T要求較高，或耗時很長(藻類生長抑制)，或需要專門的實驗場所，不利于環(huán)境監(jiān)測基層普及推廣使用。本研究在比較了國內(nèi)外各種生物毒性指標(biāo)的基礎(chǔ)上，盡可能篩選更快速、更便捷，又能覆蓋各生物層次的生物毒性方法進(jìn)行組合。因此，對《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(征求意見稿)的4項指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，將標(biāo)準(zhǔn)中使用的藻類毒性(藻類生長抑制毒性)替換為植物藻熒光抑制毒性，大幅縮減實驗時間，降低對人員的要求。這4種方法可應(yīng)用于水環(huán)境中魚類、浮游植物、浮游動物、微生物等生物鏈的毒性效應(yīng)，能更及時地監(jiān)測環(huán)境變化對生物的影響。改良優(yōu)化后的方法組合，可為化工污水處理廠尾水排放的生物毒性常態(tài)化監(jiān)控提供有力的監(jiān)測手段。

3 結(jié)論

(1) 工業(yè)園區(qū)污水處理廠進(jìn)水對大部分受試生物均具有毒性，經(jīng)過工藝處理后，出水毒性一般低于進(jìn)水，但處理工藝尤其是氧化消毒劑的使用可能會對出水的生物急性毒性造成影響。如斑馬魚卵在受納河道下游水樣中檢測到畸形發(fā)育，如果不采取措施進(jìn)行及時干預(yù)與處理，會影響水體安全并可能導(dǎo)致水環(huán)境存在潛在的健康風(fēng)險。因此應(yīng)合理選用消毒劑，并可用生物進(jìn)行毒性檢測。同時建議對污水處理廠各處理環(huán)節(jié)進(jìn)行毒性檢測，根據(jù)檢測結(jié)果優(yōu)化處理工藝，達(dá)到無毒減排的目的。

(2) 發(fā)光細(xì)菌急性毒性測試范圍最廣，適用于各類水樣的監(jiān)測；其他生物急性毒性檢測方法適用于不同類型的工業(yè)園區(qū)水質(zhì)監(jiān)測，如藻類葉綠素?zé)晒舛拘钥捎糜谥亟饘兕?、除草劑類及其他抑制光合作用廢水檢測；大型溞對化工類為主的廢水敏感度低于機(jī)械、織造類廢水；斑馬魚卵可用于檢測環(huán)境水樣對生命早期發(fā)育的影響。

建議將不同生物層級生物急性毒性指標(biāo)納入污水處理廠的常態(tài)化監(jiān)測中，為管理部門進(jìn)行污水排放監(jiān)督提供數(shù)據(jù)支撐，彌補(bǔ)理化因子監(jiān)測的不足。