于洪丹，張舒文，谷學(xué)靜

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)遼寧省糖尿病感知功能障礙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科;3.錦州醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

肝癌是導(dǎo)致全球癌癥患者死亡的第三大原發(fā)性惡性腫瘤，每年死亡人數(shù)超過60萬人。早期肝癌患者以手術(shù)為首要治療手段，但是對(duì)于中晚期肝癌或者術(shù)后化療患者仍以藥物治療為主[1-3]。植物源性中藥以其毒性低，副作用小而成為近年來關(guān)注的熱點(diǎn)。姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的重要活性成分之一，在骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種類型腫瘤中表現(xiàn)出抗腫瘤活性[4-5]，但姜黃素在肝癌中的作用及確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究[6]。本研究擬觀察姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系增殖、凋亡的影響及機(jī)制，期望為肝癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人HepG2肝癌細(xì)胞系(北納生物)，姜黃素(純度≥99%，沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室贈(zèng)送)，RPMI-1640 (BIOIND)，增強(qiáng)型CCK-8試劑盒(尚寶生物)，ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(索來寶)，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(索來寶)，單克隆抗體GAPDH(華美生物)，Cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein，YAP)、HRP標(biāo)記二抗(proteintech)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

HepG2肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，0.25%胰酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。稱取10 mg姜黃素，溶于0.5 mL DMSO，再利用培養(yǎng)基稀釋終濃度為5、10、20 μg/mL姜黃素溶液，DMSO 終濃度最高為1‰。對(duì)照組為正常培養(yǎng)基，DMSO組為含1‰的DMSO培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，控制細(xì)胞數(shù)量為2×103個(gè)/孔，貼壁后更換含有姜黃素的培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。24、48 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察拍照，再分別加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù) 培養(yǎng)1 h，于490 nm測(cè)定吸光度(A)。計(jì)算細(xì)胞活力(cell viability)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白)/(A對(duì)照組-A空白)×100%。

根據(jù)細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果，取10 μg/mL的姜黃素培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h檢測(cè)以下各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，控制細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)/孔，貼壁后分組培養(yǎng)48 h，再胰酶消化收集細(xì)胞(1×106/mL)，預(yù)冷的PBS清洗兩遍，300 g離心10 min，1 mL Bingding Buffer懸浮后棄上清，0.5 mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞于流式管中(2×105個(gè))，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育10 min，再加入5 μL PI室溫避光孵育5 min，加入PBS至500 μL。分別對(duì)Annexin V-FITC和PI染料作單陽(yáng)對(duì)照，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 DCFH-DA熒光染色檢測(cè)細(xì)胞ROS水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，控制細(xì)胞數(shù)量為2×105個(gè)/孔，貼壁后分組培養(yǎng)48 h后更換10 μM 的DCFH-DA培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，PBS清洗去掉未裝載的探針，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，控制細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)/孔，貼壁后分組培養(yǎng)48 h，用RIPA細(xì)胞裂解液提取全蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，與上樣緩沖液混合后100 ℃煮沸5 min，配制10%～12%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA進(jìn)行封閉，4 ℃孵育一抗Cleaved caspase-3、Cyt C、YAP過夜，TBST清洗3次后室溫孵育二抗2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本之間的比較采用單因素方差分析及兩兩比較的SNK檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素影響HepG2肝癌細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)

顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)影響表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性和劑量依賴性。10 μg/mL姜黃素作用48 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大量細(xì)胞失去原有形態(tài)，外形變圓，邊緣變亮，與20 μg/mL姜黃素作用24 h或48 h后細(xì)胞形態(tài)變化類似，見圖1。

圖1 姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 姜黃素抑制HepG2肝癌細(xì)胞系的增殖

CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系的增殖有明顯的抑制作用。與對(duì)照組相比，5 μg/mL姜黃素作用24 h和48 h后細(xì)胞抑制作用不明顯(P>0.05)，10 μg/mL和20 μg/mL姜黃素作用24 h和48 h均表現(xiàn)出明顯抑制效應(yīng)(P<0.05)。10 μg/mL和20 μg/mL姜黃素組與5 μg/mL姜黃素組相比，同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#P<0.05)。本研究選取10 μg/mL姜黃素處理細(xì)胞48 h開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

圖2 姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.3 姜黃素誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞系的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡比例為10.24%，DMSO組細(xì)胞凋亡比例為14.50%，兩組相比未見顯著變化(P>0.05)，而姜黃素組細(xì)胞凋亡比例達(dá)到26.74 %，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果表明姜黃素能誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞系的凋亡，見圖3。

其中右上象限代表晚期凋亡，右下象限代表早期凋亡

2.4 姜黃素促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞系ROS的產(chǎn)生

與對(duì)照組相比，姜黃素組細(xì)胞綠色熒光明顯，DMSO組無明顯變化。結(jié)果表明姜黃素組細(xì)胞ROS水平明顯升高，姜黃素能促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，見圖4。

圖4 姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響

2.5 姜黃素對(duì)YAP信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、Cyt C表達(dá)明顯升高，YAP的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，DMSO組無顯著變化(P>0.05)，見圖5。

圖5 姜黃素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

姜黃素是姜科植物姜黃根莖中存在的一種亮黃色疏水多酚類化合物，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種類型腫瘤均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性[5，7]1-13。姜黃素可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，如調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路、Notch-1信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)NF-κB、COX-2、ROS含量等[8-10]。姜黃素雙向調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，在慢性腎病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等疾病中，具有降低線粒體中活性氧類物質(zhì)、清除自由基的功能[11]；而在腫瘤細(xì)胞中，姜黃素及其類似物具有促進(jìn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能[12]。本研究中也發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著增加HepG2肝癌細(xì)胞系中ROS水平，促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生。

YAP是一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡起到重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制胰腺癌細(xì)胞中YAP-Notch信號(hào)通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖[13]，同樣在膀胱癌和結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低YAP信號(hào)通路起到抗腫瘤的作用[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯下調(diào)HepG2肝癌細(xì)胞系中YAP蛋白的表達(dá)。YAP可調(diào)控的蛋白包括細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、p53凋亡信號(hào)相關(guān)蛋白、Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白等[15-16]。此外，YAP還可以調(diào)控ROS的含量，如YAP能正調(diào)控抗氧化基因過氧化氫酶的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)ROS水平[17]。與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制HepG2肝癌細(xì)胞YAP蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)堆積，發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激。

適量的ROS能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，但大量的ROS產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。高水平的ROS能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、導(dǎo)致DNA氧化性損傷，激活p53依賴性凋亡信號(hào)通路[19]。細(xì)胞內(nèi)ROS的累積還會(huì)導(dǎo)致線粒體氧化性損傷，線粒體膜通透性發(fā)生改變，引起bcl-2家族促凋亡蛋白Bax上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C (cytochrome C，Cyt C)到胞質(zhì)中，導(dǎo)致caspase家族的凋亡執(zhí)行蛋白Caspase 3激活，最終引發(fā)細(xì)胞的凋亡過程[20]。本研究中，伴隨著ROS的堆積，HepG2肝癌細(xì)胞系發(fā)生了明顯的凋亡。因此，姜黃素可能通過誘發(fā)氧化應(yīng)激的機(jī)制誘導(dǎo)了HepG2肝癌細(xì)胞系凋亡。

綜上所述，本研究中姜黃素在HepG2肝癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，可抑制HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與姜黃素抑制YAP表達(dá)，促進(jìn)ROS在細(xì)胞內(nèi)堆積，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)凋亡反應(yīng)相關(guān)。