劉勝利，路新偉，李萍

(1.鄭州市中牟縣人民醫(yī)院病理科；2.鄭州市中牟縣人民醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 451450)

近年來(lái)，隨著大氣污染的加劇，肺癌的發(fā)病率顯著升高，嚴(yán)重影響人們健康和生活。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCL)是肺癌的主要類型，約占肺癌的80%以上[1]。目前臨床上對(duì)于NSCL多采用以手術(shù)切除為主的綜合治療方法，但腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的重要原因[2]。相關(guān)研究表明NSCL轉(zhuǎn)移與多種因素有關(guān)，金屬基質(zhì)蛋白酶-12(Metallomatrix proteinase-12，MMP-12)是一類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白酶，在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[3]。MMP-12幾乎能降解人體全部細(xì)胞外基質(zhì)，與NSCL發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)可能有密切關(guān)系[4]。而E鈣黏素(E-cadherin)則是一類可以介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)黏附的跨膜糖蛋白，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[5]。本研究分析NSCL組織中MMP-12和E-cadherin的表達(dá)及其臨床意義，旨在探討兩者在NSCL的發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年10月至2019年10月我院收治的NSCL病例100例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)高年資病理醫(yī)生確診為NSCL；(2)同時(shí)有癌組織和癌旁組織標(biāo)本；(3)術(shù)前未經(jīng)放、化療及免疫治療；(4)手術(shù)前不合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(5)無(wú)自身免疫疾?。?6)臨床病歷資料完整。男性58例，女性42例，年齡40～79歲，平均(62.58±8.26)歲；組織學(xué)分型：鱗癌43例、腺癌50例、腺鱗癌7例。TNM分期：I期20例、II期27例、III期37例、IV期16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，患者對(duì)研究知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人MMP-12、E-cadherin單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)；DAB顯色劑、酶標(biāo)羊抗兔聚合物、3%過(guò)氧化氫(購(gòu)自福建邁新生物有限公司)；免疫組化試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司)。

1.3 方法

所有病例均在手術(shù)中取病變處標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛固定，之后進(jìn)行石蠟包埋，并制成4 μm厚度連續(xù)切片。將切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗后進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)10 min，應(yīng)用3%過(guò)氧化氫去除切片中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入山羊血清，然后分別加入兔抗人MMP-12、E-cadherin生物學(xué)一抗，4 ℃下過(guò)夜，加入生物學(xué)二抗，加入DAB進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水透明，封片后在顯微鏡下觀察。用PBS代替生物學(xué)一抗進(jìn)行陰性對(duì)照，用說(shuō)明書陽(yáng)性對(duì)照樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判別[6]

MMP-12陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。將每個(gè)切片在高倍鏡(400倍)下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，按照陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色程度分別賦分：(1)細(xì)胞所占百分比計(jì)分：≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；(2)染色程度計(jì)分：無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。將兩項(xiàng)結(jié)果乘積作為總分，≥4分為陽(yáng)性，<4分為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)，并應(yīng)用Spearman相關(guān)分析數(shù)據(jù)相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCL患者癌組織和癌旁組織中MMP-12、E-cadherin蛋白表達(dá)情況比較

NSCL患者癌組織中MMP-12蛋白陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，E-cadherin蛋白陽(yáng)性率顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)表1。免疫組化染色情況見(jiàn)圖1。

A：MMP-12蛋白在NSCL癌組織中的表達(dá)400×，B：MMP-12在蛋白NSCL癌旁組織的表達(dá)400×，C：E-cadherin蛋白在NSCL癌組織中的表達(dá)400×；D：E-cadherin蛋白在NSCL癌旁組織的表達(dá)400×

表1 NSCL癌組織和癌旁組織中MMP-12、E-cadherin

2.2 NSCL患者癌組織中MMP-12、E-cadherin蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

TNM分期為III+IV期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-12蛋白陽(yáng)性率顯著高于TNM分期為I+II期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，E-cadherin蛋白陽(yáng)性率顯著低于TNM分期為I+II期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，不同性別、年齡、組織學(xué)分型中MMP-12、E-cadherin蛋白陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 NSCL患者癌組織中MMP-12、E-cadherin蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NSCL患者癌組織中MMP-12、E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，NSCL患者癌組織中MMP-12蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.573，P=0.000)。

3 討 論

NSCL主要包括鱗癌、腺癌和腺鱗癌等，是肺癌的主要病理類型，與小細(xì)胞肺癌相比，NSCL細(xì)胞增殖較為緩慢，擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，目前臨床上對(duì)NSCL主要采用以手術(shù)切除為主的綜合治療方法，通過(guò)治療可以將腫瘤病灶直接切除并系統(tǒng)清掃淋巴結(jié)，術(shù)后根據(jù)患者情況選擇放化療[7]。即便如此，近年來(lái)有報(bào)道顯示NSCL患者治療后5年存活率仍然較低，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。NSCL的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種基因的相互作用[8]。

金屬基質(zhì)蛋白酶又稱為明膠酶，是一類具有高度保守結(jié)構(gòu)的金屬內(nèi)切蛋白酶，MMP-12是金屬基質(zhì)蛋白酶家族中相對(duì)分子量較大的分子，也是金屬基質(zhì)蛋白酶家族的重要成員之一[9]。MMP-12主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌。研究表明，MMP-12可以分解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括彈性蛋白、纖維連接蛋白、I型膠原、IV型膠原、層黏連蛋白等[10]。溫源等[11]報(bào)道顯示，MMP-12可以分解纖維連接蛋白和IV型膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。莫靚等[12]報(bào)道，MMP-12可以破壞腫瘤周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤向血管內(nèi)擴(kuò)散，從而增加腫瘤的轉(zhuǎn)移幾率。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化則是促進(jìn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中的另一重要因素，當(dāng)組織發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞異型性增加，腫瘤發(fā)生演進(jìn)，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[13]。E-cadherin是一種鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，在介導(dǎo)上皮細(xì)胞連接中起到重要作用[14]。研究表明E-cadherin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵分子，當(dāng)E-cadherin表達(dá)降低時(shí)可以促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[15]。E-cadherin還可以阻斷wnt信號(hào)通路，起到維持細(xì)胞去分化的作用[16]。本研究對(duì)NSCL癌組織和癌旁組織中MMP-12、E-cadherin蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在NSCL組織中存在MMP-12蛋白異常高表達(dá)和E-cadherin蛋白異常低表達(dá)，分析其原因主要是MMP-12、E-cadherin在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用，MMP-12可能通過(guò)激活某些信號(hào)通路促進(jìn)NSCL發(fā)生，而E-cadherin失活和表達(dá)抑制可能促進(jìn)NSCL發(fā)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期為III+IV期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-12蛋白陽(yáng)性率顯著高于TNM分期為I+II期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，E-cadherin蛋白陽(yáng)性率顯著低于TNM分期為I+II期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，不同性別、年齡、組織學(xué)分型中MMP-12、E-cadherin蛋白陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明MMP-12蛋白異常高表達(dá)、E-cadherin蛋白異常低表達(dá)可以促進(jìn)NSCL的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。分析其原因可能是MMP-12通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞血管內(nèi)皮促進(jìn)NSCL癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，而E-cadherin低表達(dá)導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)NSCL癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[17]。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，NSCL患者癌組織中MMP-12蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能具有排斥作用，即MMP-12蛋白起到促進(jìn)NSCL發(fā)生、發(fā)展的作用，而E-cadherin蛋白起到抑制NSCL發(fā)生、發(fā)展的作用，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，同時(shí)也提示臨床上可以通過(guò)檢測(cè)MMP-12、E-cadherin表達(dá)情況進(jìn)而為NSCL診斷和預(yù)后判斷提供輔助參考。本次研究尚存在研究指標(biāo)過(guò)于陳舊，實(shí)驗(yàn)方法較單一的不足，后續(xù)研究將采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)完善研究并進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

綜上所述，NSCL組織中存在MMP-12異常高表達(dá)，E-cadherin異常低表達(dá)，其水平與NSCL的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，MMP-12、E-cadherin可能在NSCL輔助診斷和指導(dǎo)治療中具有一定價(jià)值。