劉歡 李翔 劉紅佶 袁銘悅 李祥玉

青光眼是繼白內(nèi)障后的世界第二大致盲性眼病[1]，高眼壓為主要的危險因素，將眼壓控制到靶眼壓范圍內(nèi)是目前青光眼的主要治療措施，可即使眼壓降至正常范圍內(nèi)，視神經(jīng)的損傷仍在繼續(xù)發(fā)展，最終致視力喪失[2]。而且，臨床上患者首次就診時，病情常常均已至中晚期、視神經(jīng)已明顯損害。因此如何保護視神經(jīng)已成為青光眼研究的重點和難點。本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法[3]建立SD大鼠慢性EIOP模型，觀察補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達的干預作用，探討補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)損害的保護機制，為補精益視片治療青光眼視神經(jīng)損害提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

健康清潔級SD大鼠30只，8～12周齡，體重160～200g，檢查無外眼部疾病，瞳孔對光反射、眼壓正常，無歪頸,由成都達碩實驗動物有限公司提供。補精益視片(批號：20170328)，購自成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；MDM2(批號：BIO11033)、p53(批號：BIO14497)抗體試劑盒，均由 BeacomBio公司提供；復合固定液由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2方法

1.2.1實驗分組及模型建立 30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和給藥組，每組10只。模型組與給藥組予烙閉大鼠右眼3支上鞏膜靜脈造模處理，對照組予暴露鞏膜上靜脈但不行烙閉處理(為假烙閉)。具體方法如下：大鼠稱重、固定、麻醉及消毒鋪巾后，在上穹隆角膜緣剪開球結膜180°，暴露鞏膜靜脈，用眼科手術烙閉器烙閉角鞏膜緣后3～4mm近赤道部約10、12和1鐘位的3支上鞏膜靜脈血管，烙閉后近角膜緣端的血管充盈擴張，遠角膜緣端的血管血流消失表示烙閉成功，術畢術眼涂金霉素眼膏，待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi)，氯霉素眼液每天2次滴眼，連續(xù)1周。

1.2.2給藥方法 造模后3天給藥，對照組、模型組予3mL生理鹽水灌胃；給藥組以1.8 g·kg-1·d-1的標準(相當于成人劑量的20倍)予補精益視片混懸液3ml灌胃。每天同一時間灌胃1次，連續(xù)8周。每2周稱大鼠體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

1.3IOP測量

用TONO-PEN眼壓計每日固定時間測量IOP。測量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后8周IOP。

1.4取材及固定

造模8周后以頸椎脫臼法處死大鼠，取眼球及視神經(jīng)在內(nèi)的組織塊，放置于中性甲醛液中固定72小時后，標本采用梯度酒精脫水，石蠟包埋，選取球后2～4mm的視神經(jīng)，做常規(guī)4μm連續(xù)切片，烘干備用。

1.5免疫組織化學法檢測視神經(jīng)MDM2、p53的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)浸泡5分鐘；10%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min，滴加適當比例稀釋的MDM2或p53，37℃孵育2h，PBS洗滌；滴加生物素標記二抗工作液，37℃孵育30min，PBS洗滌；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS洗滌；DAB顯色，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察陽性表達為棕黃色染色。每張切片隨機取5個不同視野，用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量視神經(jīng)MDM2和p53陽性染色總面積及積分光密度、平均光密度的均值，作為該玻片的測量值。

1.6統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1IOP 情況

各組大鼠造模前、造模后即刻及造模后8周IOP情況見表1。由表1可見：造模前3組眼壓比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組和給藥組的造模后即刻、造模后8周均較造模前眼壓高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組造模后8周與造模后即刻眼壓比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而給藥組造模后8周較造模后即刻眼壓低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 造模前、造模后即刻及造模后8周各組大鼠眼壓值統(tǒng)計表(單位：

2.2補精益視片對大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2表達的影響

各組視神經(jīng)MDM2表達的總面積、積分光密度、平均光密度結果見表2、圖1。由上可知，造模后模型組和給藥組視神經(jīng)MDM2表達均下降，兩組MDM2陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度較對照組低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組MDM2陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度與給藥組相比，明顯偏低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組視神經(jīng)MDM2的表達情況

圖1 各組視神經(jīng)MDM2免疫組化陽性染色(×400)。A：對照組; B：模型組; C：給藥組

2.3補精益視片對大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路p53表達的影響

各組視神經(jīng)免疫組化檢測p53表達的總面積、積分光密度、平均光密度結果見表3、圖2。由上可知，造模后模型組和給藥組視神經(jīng)p53均上升，兩組p53陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度均較對照組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組p53陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度與給藥組相比，明顯偏高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組視神經(jīng)p53的表達情況

圖2 各組視神經(jīng)p53免疫組化陽性染色(×400)。A：對照組; B：模型組; C：給藥組

3 討論

PI3K/Akt信號通路為近年來基因調(diào)控細胞凋亡的研究熱點。PI3K/Akt信號通路有促進神經(jīng)元存活的作用[4-6]。國外已有實驗證明PI3K/Akt信號通路對RGCs的凋亡過程起抑制作用[7]，但具體作用機理仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路對于神經(jīng)細胞的存活有著特殊的重要性。我們前期對大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路中p-Akt的表達進行了分析，證實了通過上調(diào)p-Akt的表達可修復和保護RGCs[8]。MDM2、p53亦為PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路中的相關因子，PI3K為整個信號通路的起點，PI3K被激活后，激活后的產(chǎn)物與Akt的PH結構域結合，實現(xiàn)激活Akt，激活后的Akt使MDM2的第166位和188位絲氨酸磷酸化，增加MDM2蛋白的穩(wěn)定性，促進p53降解，從而對細胞發(fā)揮作用[5]。MDM2是對細胞生長有調(diào)節(jié)作用的癌基因，對細胞有增強生存活力、延長生存期及促進增生等作用[9]。p53是人體重要的腫瘤抑制因子，具有調(diào)控細胞DNA修復和誘導細胞衰老、自噬、凋亡等作用[10]。MDM2和p53在細胞內(nèi)互相制衡，MDM2抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，促進p53降解；p53翻譯MDM2，激活MDM2基因轉(zhuǎn)錄，二者形成負反饋調(diào)節(jié)。病理情況下，當MDM2減少，不能降解或抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，使p53在細胞內(nèi)的含量增加，導致細胞周期停滯或凋亡。

青光眼歸屬于中醫(yī)的“五風內(nèi)障”，多由風火痰虛瘀等導致氣血失和、氣滯血瘀、玄府閉塞、神水瘀積，日久肝腎兩虧、神光衰微甚至泯滅，不睹三光而成青盲(青光眼視神經(jīng)損害),故肝腎不足、脈絡瘀滯為青光眼視神經(jīng)損害的主要病機。補精益視片(原名益視片)，是中醫(yī)眼科名家陳達夫據(jù)古方“駐景丸”加減化裁而成，由菟絲子、楮實子、枸杞子、五味子、茺蔚子、車前子、丹參、三七、青皮、木瓜組成，具有滋養(yǎng)肝腎、活血通絡的功效，為補腎活血法的代表方?，F(xiàn)代藥理研究表明補精益視片中多種藥物均含各種微量元素、氨基酸等成分，能調(diào)節(jié)免疫，保持機體內(nèi)環(huán)境的平衡[11]。前期研究亦證實：補精益視片能輕度降低眼壓[12]，保護SD大鼠慢性高眼壓模型的RGCs[13]，抑制感光細胞凋亡，修復視網(wǎng)膜和提高視力[14]等。

本研究通過觀察補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達的干預作用。結果發(fā)現(xiàn)，補精益視片能輕度降低SD大鼠慢性EIOP模型的眼壓，上調(diào)視神經(jīng)PI3K/Akt通路凋亡抑制因子MDM2、下調(diào)凋亡促進因子p53的表達，推測補精益視片保護青光眼視神經(jīng)的作用機制可能是通過降眼壓及調(diào)控PI3K/Akt通路的多個相關因子來實現(xiàn)的。