竇 慧 朱 珠 鈕曉紅

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染肺實(shí)質(zhì)以外的部位引起的結(jié)核稱為肺外結(jié)核，淋巴結(jié)核作為一種最常見(jiàn)的肺外結(jié)核，屬中醫(yī)學(xué)“瘰疬”范疇，如不進(jìn)行及時(shí)的診斷和治療患處易潰爛、流膿，并難以愈合，特別是免疫系統(tǒng)受到抑制的患者，易危及生命[1]。MTB感染后患者會(huì)呈現(xiàn)非常強(qiáng)的抗原特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和效應(yīng)性T細(xì)胞（Teffs）在其中發(fā)揮著重要的作用。淋巴結(jié)核是一種在淋巴結(jié)中引起的肉芽腫性免疫反應(yīng)性疾病，而肉芽腫的形成主要是由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子相互作用完成[2]。因淋巴結(jié)核的病原菌是結(jié)核桿菌，臨床上通常使用抗結(jié)核三聯(lián)西藥治療[3]64，西藥聯(lián)合殺菌抑菌作用雖然有效，但常常會(huì)因耐藥而使疾病失控，因此臨床上迫切需要其他有效且副作用較小的藥物。瘰疬寧為南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院研發(fā)的抗淋巴結(jié)核中藥，前期研究結(jié)果表明，其治療淋巴結(jié)核有效[4]，且可提高外周血T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力[5]，證明瘰疬寧可參與抗結(jié)核治療過(guò)程中機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。本研究旨在進(jìn)一步研究瘰疬寧對(duì)Tregs、Teffs及對(duì)結(jié)核相關(guān)炎癥細(xì)胞因子白介素（IL）-2、IL-4、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）表達(dá)水平的影響，探究瘰疬寧是否通過(guò)調(diào)節(jié)這兩種免疫細(xì)胞和相關(guān)炎癥細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2016年7月至2017年12月南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科204例確診為淋巴結(jié)核的患者，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組與對(duì)照組，每組102例。治療組男50例，女52例；年齡19～65歲，平均年齡（40.33±14.32）歲；病程7～7 300 d，平均病程（373.4±104.0）d；病灶部位在頸部92例，腋下8例，腹股溝2例；單側(cè)56例，雙側(cè)46例；腫塊46例，膿腫33例，破潰23例。對(duì)照組男46例，女56例；年齡18～70歲，平均年齡（39.92±14.35）歲；病程7～7 300 d，平均病程（360.9±103.7）d；病灶部位在頸部89例，腋下9例，腹股溝4例；單側(cè)58例，雙側(cè)44例；腫塊45例，膿腫36例，破潰21例。2組患者性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，批件號(hào)：201403001。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》[3]27和《中醫(yī)外科常見(jiàn)病診療指南》[6]中淋巴結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（1）淋巴結(jié)增大或融合成團(tuán)，或化膿破潰；（2）病灶組織或膿液做MTB rpoB基因和突變的檢測(cè)為陽(yáng)性；（3）穿刺液中查到MTB；（4）病理檢查：結(jié)核病理學(xué)典型特征及抗酸染色陽(yáng)性。以病原學(xué)及病理學(xué)診斷為主要依據(jù)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合淋巴結(jié)核西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡在18～70歲，男女不限；（3）自愿參加本研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 已經(jīng)抗結(jié)核1個(gè)月以上者；合并心腦血管、肝、腎及血液系統(tǒng)異常等嚴(yán)重疾病者；全身結(jié)核桿菌感染或活動(dòng)性肺結(jié)核患者；孕期或哺乳期女性。

2 治療方法

2.1 對(duì)照組 采用常規(guī)抗結(jié)核三聯(lián)西藥治療并予安慰劑。異煙肼（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：T16B031，規(guī) 格：0.1 g×100片），3片/次，1次/d；利 福平（沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司，批號(hào)：1609211，規(guī)格：0.15 g×100粒），3粒/次，1次/d，晨起空腹服；乙胺丁醇（上海新亞藥業(yè)閔行有限公司，批號(hào)：063160652，規(guī)格：0.25 g×100片）3片/次，1次/d。安慰劑（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格：0.5 g×100粒，主要藥物組成：淀粉），4粒/次，3次/d。

2.2 治療組 在對(duì)照組西藥治療的基礎(chǔ)上加服瘰疬寧。瘰疬寧（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室，批號(hào)：44160507，規(guī)格：0.5 g×100粒，主要藥物組成：梓木草、夏枯草，2006年獲得國(guó)家發(fā)明專利[7]，2013年獲得醫(yī)院制劑批號(hào)：蘇藥制字Z20130001），4粒/次，3次/d。

2組療程均為4周。

3 療效觀察

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 Tregs和Teffs表達(dá)水平 2組患者治療前后抽取外周靜脈血，用相應(yīng)的熒光抗體染色后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)Tregs和Teffs的表達(dá)水平。

3.1.2 炎癥因子水平 采用酶聯(lián)免疫吸附術(shù)（ELISA）檢測(cè)2組患者治療前后血清IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α、IFN-γ的表達(dá)水平。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用 t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì) t 檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 治療結(jié)果

3.3.1 2組患者治療前后外周血Tregs和Teffs表達(dá)水平比較 2組患者治療前外周血Tregs和Teffs表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組治療后上述指標(biāo)與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療組治療后Tregs表達(dá)水平明顯低于治療前和對(duì)照組治療后（P＜0.01），Teffs表達(dá)水平明顯高于治療前和對(duì)照組治療后（P＜0.05）。見(jiàn)表1。治療前后Tregs流式圖比較見(jiàn)圖1和圖2，治療前后Teffs流式圖比較見(jiàn)圖3。

表1 治療組與對(duì)照組治療前后Tregs和Teffs表達(dá)水平比較（）

表1 治療組與對(duì)照組治療前后Tregs和Teffs表達(dá)水平比較（）

注： 與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與對(duì)照組治療后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 例數(shù) 時(shí)間 Tregs/% Teffs/%治療組 102 治療前 7.63±1.51 2.67±1.03治療后 5.05±2.21**## 3.62±1.11*#對(duì)照組 102 治療前 7.62±1.54 2.67±1.04治療后 7.60±3.28 2.68±1.02

圖1 治療組治療前后Tregs的百分?jǐn)?shù)含量比較

圖2 對(duì)照組治療前后Tregs的百分?jǐn)?shù)含量比較

圖3 治療組與對(duì)照組治療前后Teffs表達(dá)變化情況

3.3.2 2組患者治療前后炎癥因子表達(dá)水平比較 2組患者治療前IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組治療后上述指標(biāo)與治療前比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療 組 治 療 后TNF-α、IFN-γ表達(dá)明顯低于治療前和對(duì)照組治療后（P＜0.05，P＜0.01），其余指標(biāo)組內(nèi)及組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

4 討論

結(jié)核病是世界上導(dǎo)致健康不良和死亡的主要原因，全球每年就有1 000多萬(wàn)的新發(fā)結(jié)核患者[8]。結(jié)核分為肺結(jié)核和肺外結(jié)核，肺外結(jié)核可影響人體幾乎所有的器官，其中就包括淋巴結(jié)核[9]。淋巴結(jié)核在傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)上被稱為“瘰疬”，是以出現(xiàn)豆粒大小的腫塊，緩慢增大增多，或膿腫潰爛為主要特征的慢性感染性疾病。

當(dāng)大量結(jié)核桿菌進(jìn)入機(jī)體，固有免疫應(yīng)答啟動(dòng)，外周淋巴器官和組織誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，進(jìn)而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Tregs約占循環(huán)CD4+T細(xì)胞的5%～10%，對(duì)T細(xì)胞的增殖具有抑制作用[10]，在結(jié)核的疾病進(jìn)展過(guò)程中，Tregs表達(dá)量升高并可導(dǎo)致疾病易感性[11]。此外，抗原特異性的Tregs可增加機(jī)體感染細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)[12]。早期結(jié)核病人的病原特異性Tregs可延遲Teffs到達(dá)感染灶，而且即使是少量MTB特異性的Tregs也能延遲CD4+、CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞在淋巴結(jié)內(nèi)的免疫啟動(dòng)，強(qiáng)力限制機(jī)體的保護(hù)性免疫反應(yīng)[13]。Tregs一方面在防止炎癥介導(dǎo)的對(duì)宿主組織損傷方面可能起積極作用，但另一方面在結(jié)核桿菌感染啟動(dòng)T細(xì)胞反應(yīng)方面則可能起消極作用，結(jié)核桿菌通過(guò)誘導(dǎo)Tregs擴(kuò)增，抑制或延遲獲得性免疫啟動(dòng)，導(dǎo)致結(jié)核桿菌繁殖[14]。

肉芽腫是結(jié)核桿菌繁殖和居留的主要場(chǎng)所[15]，肉芽腫內(nèi)結(jié)核免疫反應(yīng)的局限化可能是結(jié)核桿菌不能被完全清除進(jìn)而形成慢性感染的原因之一，效應(yīng)T細(xì)胞（Teffs）是機(jī)體免疫功能的執(zhí)行細(xì)胞，其活化后可殺滅結(jié)核桿菌。CD8+初始T細(xì)胞在同樣情況下較CD4+初始T細(xì)胞更容易分化成效應(yīng)/記憶T細(xì)胞，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）是解決胞內(nèi)細(xì)菌的關(guān)鍵，CTL功能失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)核桿菌逃逸[16]。在結(jié)核性淋巴結(jié)的肉芽腫的損傷中CD8+T細(xì)胞與Tregs細(xì)胞的比值顯著降低[17]。我們的研究結(jié)果也表明，與傳統(tǒng)西藥相比，瘰疬寧可通過(guò)抑制Tregs和上調(diào)Teffs的表達(dá)，維持Teffs/Tregs之間的免疫平衡，提高結(jié)核病人低下的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗結(jié)核治療作用。

表2 治療組與對(duì)照組治療前后炎癥因子表達(dá)水平比較（）

表2 治療組與對(duì)照組治療前后炎癥因子表達(dá)水平比較（）

注： 與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與對(duì)照組治療后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 例數(shù) 時(shí)間 IL-2/（ng/mL） IL-4/（ng/mL） IL-10/（ng/mL） TNF-α/（pg/mL） IFN-γ/（pg/mL）治療組 102 治療前 2.09±0.41 13.01±3.31 12.44±4.21 19.67±6.54 325.1±47.88治療后 2.12±0.93 12.41±5.64 12.81±5.36 14.58±4.70*# 263.3±54.39**##對(duì)照組 102 治療前 2.08±0.42 12.96±3.30 12.40±4.16 19.45±6.57 326.8±48.73治療后 2.09±1.64 12.51±5.33 12.45±8.20 19.09±5.08 325.6±63.79

細(xì)胞因子是一把“雙刃劍”，既能清除免疫系統(tǒng)感染，也會(huì)使機(jī)體遭到嚴(yán)重?fù)p害，因此，全面了解與結(jié)核疾病有關(guān)的細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ是十分必要的。CD4+T細(xì)胞亞型包括輔助性T細(xì)胞1型（Th1）和輔助性T細(xì)胞2型（Th2），其中Th1分泌的細(xì)胞因子有IL-2、TNF-α和IFN-γ等，Th2分泌的細(xì)胞因子有IL-4和IL-10等。IL-2是T細(xì)胞增殖的刺激因子，與肉芽腫的形成有關(guān)，IL-10的作用與IL-2相反，可抑制T細(xì)胞的增殖；IL-4與多核巨細(xì)胞的形成有關(guān)；TNF-α是參與肉芽腫形成和巨噬細(xì)胞活化的重要組分[18]；IFN-γ也與結(jié)核的疾病進(jìn)程息息相關(guān)[19]。我們的研究結(jié)果表明，對(duì)照組和治療組藥物干預(yù)前后Th1分泌的細(xì)胞因子IL-2和Th2分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-10表達(dá)水平并沒(méi)有顯著的差別。TNF-α是由Th1細(xì)胞合成的對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)及組織損傷起重要調(diào)節(jié)作用的因子，有研究報(bào)道肺結(jié)核患者胸腔積液TNF-α的表達(dá)明顯升高[20]。IFN-γ是第一個(gè)被人類發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[21]。有文獻(xiàn)指出，肺結(jié)核患者血清中IFN-γ含量明顯升高[22]。我們的研究結(jié)果顯示，瘰疬寧可以降低TNF-α和IFN-γ這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕結(jié)核桿菌感染引起的炎癥反應(yīng)，減少淋巴結(jié)病變組織的壞死和液化。

綜上，瘰疬寧可抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Tregs和促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞Teffs的表達(dá)，發(fā)揮其治療淋巴結(jié)核作用的同時(shí)，還降低了炎性細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的含量，進(jìn)而減少炎癥過(guò)度反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損害。因此，臨床上在常規(guī)西藥的基礎(chǔ)上加用瘰疬寧來(lái)治療淋巴結(jié)核，既可增強(qiáng)療效，又能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而減少耐藥病例，瘰疬寧越早使用效果越佳。截至目前，我們的研究?jī)?nèi)容也僅限于藥物對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的影響，瘰疬寧到底通過(guò)什么途徑影響這些細(xì)胞及細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮其治療功效，是否有相關(guān)的信號(hào)通路，以及瘰疬寧是否也會(huì)影響其他細(xì)胞，這些都是我們以后研究的重點(diǎn)。