吳烜，童剛領(lǐng)，程勃然，余少康，靳楓，王樹濱

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院 腫瘤科；深圳市胃腸腫瘤轉(zhuǎn)化研究重點實驗室；深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)腫瘤研究所，廣東 深圳 518036）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大常見的惡性腫瘤，且是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1-2]。得益于HCC診斷和治療的進展，HCC病死率逐漸降低，但HCC患者預(yù)后仍不理想[3]。手術(shù)切除仍是治療HCC的最有效方法，小HCC切除術(shù)后1年生存率可達80%以上，5年生存率接近50%[4-5]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高是HCC患者預(yù)后不良的主要因素[6]。HCC切除術(shù)后復(fù)發(fā)率在前2年約為50%，在5年內(nèi)增加至75%[7]。探索影響HCC預(yù)后的生物標志物有助于預(yù)測HCC復(fù)發(fā)和預(yù)后，改善患者的治療效果[8]。

雙特異性磷酸酶2（dual-specificity phosphatase 2，DUSP2）又名活化細胞磷酸酶1（procaspase-activating compound 1，PAC-1），是蛋白酪氨酸磷酸酶基因超家族成員之一，其主要功能是特異性將絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）中的磷酸絲氨酸/蘇氨酸和磷酸酪氨酸殘基去磷酸化，通過滅活MAPK調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)DUSP2可作為結(jié)腸癌[10]、胰腺導(dǎo)管腺癌[11]及卵巢癌[12]的腫瘤抑制因子。盡管如此，DUSP2在HCC中的表達及臨床意義仍不清楚。本研究通過免疫組化評估DUSP2在HCC組織中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 患者和組織標本

本研究納入中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院和中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科于2010年1月—2014年 12月間診斷為HCC并接受肝癌切除術(shù)的104 例患者。納入標準：⑴ 所有患者均經(jīng)病理確診為HCC，且不存在其他原發(fā)性腫瘤；⑵ 手術(shù)前未接受化療或放療；⑶ 所有患者均接受肝癌切除術(shù)治療；⑷ 具有完整的臨床和隨訪信息。排除標準：患者隨訪資料缺失者。最終納入HCC患者104例，平均年齡為53歲（范圍20～90歲），男女比例為3:7，腫瘤直徑＞5 cm占59.61%（n=62），多灶性腫瘤占29.81%（n=31），遠處（肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及門靜脈癌栓）轉(zhuǎn)移占患者 59.61%（n=62），血清甲胎蛋白（AFP）＞400 ng/mL占47.00%（n=47），乙型肝炎病毒（HBV）水平＞1000 IU/mL占67.00%（n=67）。本研究征得醫(yī)院倫理委員會同意并實施。

1.2 患者隨訪

隨訪通過定期門診和電話方式進行，隨訪時間從病理診斷日期到死亡或隨訪截止日期。其中無瘤生存時間為術(shù)后病理診斷日期到隨訪期間首次發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或隨訪截止日期間的時間間隔?？偵鏁r間為術(shù)后病理診斷日期到隨訪期間死亡或隨訪截止日期間的時間間隔。中位隨訪36個月（范圍1～72個月），每半年隨訪1次，隨訪期間共有 34例（32.69%）患者死亡，27例（25.96%）發(fā)生復(fù)發(fā)。

1.3 患者組織標本免疫組織化學(xué)染色

手術(shù)切除的HCC組織標本經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋后切成4 μm厚的切片，經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶方法染色切片。步驟簡述如下：將切片脫石蠟、水合，室溫下在3%H2O2中浸泡15 min，與DUSP2多克隆抗體（1:800，Santa Cruz，美國）一起溫育1 h。陰性對照采用非免疫兔IgG與第一抗體相同稀釋度孵育。

1.4 免疫組化評分

免疫組化評分[13]由染色強度和陽性細胞百分比二個維度組成，強度評分如下：0 為無表達；1為弱表達，2為中度表達和3為強表達；陽性染色的百分比評分如下：0為無染色，1為≤25%陽性細胞染色，2為26%～50%陽性細胞染色，3為51%～75%陽性細胞染色，4為≥76%陽性細胞染色。將DUSP2表達的百分比和強度相乘，得分范圍為0～12分。由2名病理醫(yī)師采用雙盲法獨立評估免疫組化評分，并根據(jù)免疫組化評分結(jié)果將患者分為兩組[13]：DUSP2低表達組為免疫組化評分≤4，DUSP2高表達組為免疫組化評分＞4。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 21.0 版本（SPSS，Chicago，IL）軟件分析數(shù)據(jù)，χ2檢驗用于分析DUSP2表達與臨床病理因素間的關(guān)系，Kaplan-Meier生存函數(shù)行生存分析并使用對數(shù)秩檢驗比較，Cox比例風(fēng)險回歸模型用于多變量分析，所有統(tǒng)計檢驗均為雙尾，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DUSP2 在HCC 組織中的表達

在104例HCC癌組織中，DUSP2主要在癌細胞細胞質(zhì)中表達，染色呈陽性（圖1），DUSP2高表達占59.6%（62/104），DUSP2低表達占40.4%（42/104）。

圖1 HCC 癌組織中DUSP2 表達的免疫組化圖（×100）Figure 1 The immunohistochemical staining for DUSP2 expression in HCC tissue (×100)

2.2 HCC 組織中DUSP2 表達與患者臨床病理因素的關(guān)系

HCC癌組織中DUSP2表達與HCC患者的年齡、性別和腫瘤大小無明顯關(guān)系（均P＞0.05），而與腫瘤分化程度（P=0.018）、腫瘤數(shù)目（P=0.048）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.001）、血清HBV濃度（P=0.018）明顯有關(guān)（表1）。

2.3 DUSP2 表達與患者無瘤生存率和總生存率的關(guān)系

DUSP2 低表達組患者3年無瘤生存率為25.2%，DUSP2高表達組患者3年無瘤生存率為63.3%，DUSP2低表達組無瘤生存率低于DUSP2高表達組患者（P=0.004）（圖2A）；DUSP2低表達組患者3年總生存率為42.5%，DUSP2高表達組患者3年總生存率為85.5%，DUSP2低表達組總生存率低于DUSP2高表達組患者（P=0.002）（圖2B）。

表1 DUSP2 表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of DUSP2 expression with the clinicopathologic characteristics [n (%)]

圖2 不同DUSP2 表達狀態(tài)HCC 患者的生存曲線Figure 2 The survival curves of HCC patients with different DUSP2 expression levels

2.4 影響HCC 患者無瘤生存率的單因素和多因素分析

Cox比例風(fēng)險回歸模型單因素分析顯示，腫瘤大小（P=0.048）、分化程度（P=0.026）、腫瘤數(shù)目（P=0.025）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.005）、AFP濃度（P=0.031）及DUSP2低表達（P=0.006）是影響HCC患者無瘤生存率的危險因素，多因素分析顯示分化程度（P=0.016）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.025）及DUSP2表達（P=0.036）是影響HCC患者無瘤生存率的獨立危險因素（表2）。

2.5 影響HCC 患者術(shù)后總生存率的單因素和多因素分析

Cox比例風(fēng)險回歸模型單因素分析顯示，腫瘤大?。≒=0.018）、分化程度（P=0.016）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.002）及DUSP2表達（P=0.009）是影響HCC患者總生存率的危險因素，多因素分析顯示分化程度（P=0.023）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.015）及DUSP2表達（P=0.016）是影響HCC患者總生存率的獨立危險因素（表3）。

表2 影響HCC 患者術(shù)后無瘤生存率的單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors for tumor-free survival rate in HCC patients

表3 影響HCC 患者術(shù)后總生存率的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of factors for overall-free survival rate in HCC patients

3 討 論

因發(fā)病隱匿、進展快、預(yù)后差，HCC一直是研究的熱點和難點。HCC的發(fā)生與發(fā)展是一系列多分子參與的多步驟過程，包括miRNA[14]、lncRNA[15]等分子。研究與HCC預(yù)后相關(guān)的分子標志物對改善患者預(yù)后具有重要意義[16-17]。

DUSP2是核I型DUSP家族的成員，可以抑制絲MAPK的激活，并在免疫過程、炎癥反應(yīng)和癌癥進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-19]，其作為MAPK關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子，還可調(diào)節(jié)MAPKs亞細胞定位[20]。DUSP2調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎性疾病中的Erk1/2和p38信號途徑而參與癌癥的多種生物學(xué)過程[21]。本研究對104例HCC患者術(shù)后病理組織標本行免疫組化發(fā)現(xiàn)DUSP2低表達者占59.6%，DUSP2高表達者占40.4%。在膀胱癌組織及細胞系[22]中，通過免疫組化及PCR檢測發(fā)現(xiàn)DUSP2呈低表達，提示在不同類型腫瘤中DUSP2蛋白呈 異質(zhì)性。HCC癌組織中DUSP2低表達與與腫瘤低分化、多個腫瘤、轉(zhuǎn)移、血清HBV濃度高、AFP水平高等惡性生物學(xué)特征顯著相關(guān)。在漿液型卵巢癌[12]患者中，癌組織中DUSP2 mRNA低表達與卵巢癌患者FIGO分期高、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，上述結(jié)果提示，DUSP2低表達患者可能預(yù)后不佳。

DUSP2低表達組患者無瘤生存率和總生存率均顯著低于DUSP2高表達組患者，進一步分析示DUSP2表達是預(yù)測HCC患者無瘤生存率和總生存率的獨立危險因素，上述研究結(jié)果顯示DUSP2是HCC患者新的潛在的、可用于預(yù)測患者預(yù)后的生物標志物，其潛在機制尚不清楚。有文獻[23]報道，在低氧誘導(dǎo)因子1α誘導(dǎo)下，DUSP2 mRNA及蛋白質(zhì)在幾種腫瘤及相應(yīng)的細胞系中表達下調(diào)。最新的分子機制研究顯示在結(jié)腸癌病理組織中DUSP2表達下調(diào)可促進白細胞介素8釋放，促進腫瘤血管生成和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，可能與缺氧條件下腫瘤激活Erk1/2介導(dǎo)的信號通路有關(guān)[9]。DUSP2通過促進胰腺導(dǎo)管腺癌中Erk1/2失活來逆向調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白，增強miR-361-3p介導(dǎo)的DUSP2 mRNA降解[11]。在膀胱癌中，腫瘤抑制因子p53介導(dǎo)的細胞生長抑制和凋亡也依賴于DUSP2表達[24]。本研究發(fā)現(xiàn)DUSP2低表達與HCC患者腫瘤進展密切相關(guān)，其潛在分子機制尚需要進一步研究。

DUSP2在癌癥中的臨床意義一直存在爭議。DUSP2低表達與結(jié)腸癌總生存率差及遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，具有DUSP2的rs1724120變異等位基因的結(jié)腸癌患者術(shù)后生存率較差[26]。與之相反，在卵巢癌患者中，漿液型卵巢癌患者癌組織中DUSP2 mRNA水平顯著高于鄰近癌旁組織，且DUSP2過表達患者預(yù)后較低表達者差[12]。最新研究[22]顯示在膀胱癌患者中，DUSP2低表達組患者總生存率顯著低于DUSP2高表達組患者。在本研究中，Kaplan-Meier曲線和Cox回歸分析表明，DUSP2低表達組HCC患者預(yù)后差于DUSP2高表達組患者，與結(jié)直腸癌[25]和膀胱癌[22]報道一致，而與卵巢癌結(jié)果相反，提示DUSP2在不同腫瘤中的表達具有異質(zhì)性，在不同類型的腫瘤中可能扮演著不同的角色，其在HCC中可能發(fā)揮潛在的腫瘤抑制作用。

本研究存在如下不足：首先本研究作為單中心回顧性研究，納入病例數(shù)目較少，尚需要多中心大樣本研究用于驗證本研究結(jié)論；其次，本研究并未深入探討HCC患者癌組織中DUSP2差異性表達和DUSP2 可作為評估HCC患者預(yù)后的潛在分子機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)DUSP2表達與HCC患者腫瘤分化程度、腫瘤數(shù)目及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，DUSP2低表達患者預(yù)后較DUSP2高表達患者差，是HCC患者潛在的與預(yù)后相關(guān)的分子標志物。

聲明：本研究于作者在中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院和中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進修學(xué)習(xí)期間完成。